Pipetlərin uclarının və EP borularının sterilizasiyası və s.
1. Deionlaşdırılmış su ilə 0,1% (mində bir) DEPC (yüksək zəhərli maddə) hazırlayın, ondan ehtiyatla duman qapağında istifadə edin və 4°C-də işıqdan uzaqda saxlayın;
DEPC suyu DEPC ilə işlənmiş və yüksək temperatur və yüksək təzyiqlə sterilizasiya edilmiş təmiz sudur.RNaz, DNaz və proteinazdan azad olduğu sınaqdan keçirilmişdir.
2. Pipetin ucunu və EP borusunu 0,1% DEPC-yə qoyun və pipetin ucunun və EP borusunun 0,1% DEP ilə doldurulduğundan əmin olun.
3. İşıqdan qoruyun, dayanmasına icazə verin, bir gecədə (12-24 saat)
4. Ucu və EP borusunu ehtiva edən qutunun DEPC-də islanmasına ehtiyac yoxdur.Ucu və ya EP borusundan DEPC suyunu kobud şəkildə çıxardıqdan sonra onu qablaşdırın və sarın.
5. 121 dərəcə Selsi, 30 dəq
6. 180 dərəcə Selsi, bir neçə saat quru (ən azı 3 saat)
Qeyd: a.DEPC ilə işləyərkən lateks əlcəklər və maskalar taxın!b, və ya DEPC sterilizasiyası olmadan, 130 ℃, 90 dəqiqə avtoklav (bir çox laboratoriyalarda iki dəfə yüksək temperaturda sterilizasiya)
RNT ekstraksiyasının mülahizələri
Toxuma RNT izolyasiyasının uğursuzluğunun iki əsas hadisəsi
RNT deqradasiyası və toxumalarda çirklərin qalıqları,deqradasiya ilə əlaqədar olaraq, gəlin əvvəlcə mədəni hüceyrələrdən çıxarılan RNT-nin niyə asanlıqla parçalanmadığına baxaq.Mövcud RNT ekstraksiya reagentlərinin hamısında RNaz-ı sürətlə inhibə edən komponentlər var.Lizatı mədəni hüceyrələrə əlavə edin və sadəcə qarışdırın, bütün hüceyrələr lizatla yaxşıca qarışdırıla bilər və hüceyrələr tamamilə parçalanır.Hüceyrələr parçalandıqdan sonra lizatdakı aktiv maddələr dərhal hüceyrədaxili RNaz-ı inhibə edir, beləliklə RNT toxunulmaz qalır.Yəni becərilmiş hüceyrələr lizatla asanlıqla və tam təmasda olduqları üçün onların RNT-si asanlıqla parçalanmır;digər tərəfdən, toxumadakı RNT asanlıqla parçalanır, çünki toxumadakı hüceyrələrin lizatla tez təmasda olması asan deyil.kifayət qədər təmas sayəsində.Belə ki,RNT fəaliyyətini maneə törətməklə toxumanı tək hüceyrəyə çevirmək üçün bir yol olduğunu fərz etsək, deqradasiya problemi tamamilə həll edilə bilər.
Maye azot frezeleme ən təsirli belə üsuldur.Bununla belə, maye azot frezeleme üsulu, xüsusən də nümunələrin sayı çox olduqda, çox əziyyətlidir.Bu, növbəti ən yaxşı şeyə səbəb oldu: homogenizator.Thehomojenizatormetod, hüceyrələrin lizatla təmas etməzdən əvvəl RNaz fəaliyyətinin necə inhibə edildiyi sualını nəzərdən keçirmir, əksinə, toxuma pozulma sürətinin hüceyrədaxili RNaz-ın RN-ni parçaladığı sürətdən daha sürətli olması üçün dua edir.
Elektrikli homojenizatorun təsiri daha yaxşıdır,və şüşə homogenizatorun təsiri zəifdir, lakin ümumiyyətlə, homojenizator üsulu deqradasiya fenomeninin qarşısını ala bilməz.Buna görə, əgər ekstraksiya pozulursa, maye azotla üyüdülmə üçün orijinal elektrik homogenizatoru istifadə edilməlidir;orijinal şüşə homojenizator elektrik homogenizatoruna dəyişdirilməlidir və ya birbaşa maye azotla öğütülməlidir.Problem demək olar ki, 100% mümkündür.həll olunsun.
Sonrakı təcrübələrə təsir edən çirkli qalıq probleminin deqradasiyadan daha müxtəlif səbəbləri var və həll yolları da müvafiq olaraq fərqlidir.Yekun olaraq,toxumada deqradasiya və ya qalıq çirklər varsa, xüsusi eksperimental material üçün ekstraksiya üsulu/reagent optimallaşdırılmalıdır.Optimallaşdırma üçün qiymətli nümunələrinizdən istifadə etməyə ehtiyac yoxdur: siz bazardan balıq/toyuq kimi kiçik heyvanlar ala bilərsiniz, materialın müvafiq hissəsini RNT-nin çıxarılması üçün, digər hissəsini isə zülal çıxarılması üçün götürə bilərsiniz – ağız, mədə və bağırsaq ekstraktı ilə üyüdün.
Çıxarılan RNT-nin hədəf RNT-si müxtəlif təqib təcrübələri üçün istifadə olunur və onun keyfiyyət tələbləri fərqlidir
cDNA kitabxanasının qurulması ferment reaksiya inhibitorlarının qalıqları olmadan RNT bütövlüyünü tələb edir;Şimal daha yüksək RNT bütövlüyü və ferment reaksiya inhibitorlarının qalıqları üçün daha aşağı tələblər tələb edir;RT-PCR çox yüksək RNT bütövlüyü tələb etmir,lakin ferment reaksiyalarını maneə törədir.Qalıq tələbləri ciddidir.Giriş çıxışı müəyyən edir;hər dəfə məqsəd ən yüksək saflıqda RNT əldə etməkdir, bu, insanlara və pula başa gələcək.
Nümunələrin toplanması/saxlanması
Deqradasiyaya təsir edən amillər Nümunə canlı orqanizmi/və ya orijinal böyümə mühitini tərk etdikdən sonra nümunədəki endogen fermentlər RNT-ni deqradasiya etməyə başlayacaq,və deqradasiya dərəcəsi endogen fermentlərin məzmunu və temperaturla bağlıdır.Ənənəvi olaraq, endogen ferment fəaliyyətini tamamilə maneə törətməyin yalnız iki yolu var: dərhal lizat əlavə edin və hərtərəfli və sürətlə homojenləşdirin;kiçik parçalara kəsin və dərhal maye azotda dondurun.Hər iki yanaşma sürətli əməliyyat tələb edir.Sonuncu bütün nümunələr üçün uyğundur, birincisi isə yalnız aşağı hüceyrə və endogen fermentlərə malik olan və homojenləşməsi daha asan olan toxumalar üçün uyğundur.Xüsusilə, bitki toxuması, qaraciyər, timus, mədəaltı vəzi, dalaq, beyin, yağ, əzələ toxuması və s. davam etməzdən əvvəl ən yaxşı şəkildə maye azotla dondurulur.
Nümunələrin parçalanması və homogenləşməsi
Deqradasiyaya və məhsula təsir edən amillər Nümunə parçalanmasıdırhərtərəfli homogenləşmə üçün, RNT-nin tam və tam sərbəst buraxılması üçündür.Hüceyrələr qırılmadan birbaşa homojenləşdirilə bilər.Dokular yalnız qırıldıqdan sonra homojenləşdirilə bilər.Maya və bakteriyalar homojenləşmədən əvvəl müvafiq fermentlərlə parçalanmalıdır.Aşağı endogen ferment tərkibli və daha asan homogenləşməyə malik olan toxumalar homogenizator vasitəsilə bir dəfə lizatda əzilə və homogenləşdirilə bilər;bitki toxuması, qaraciyər, timus, mədəaltı vəzi, dalaq, beyin, yağ, əzələ toxuması və digər nümunələr, Onlar ya endogen fermentlərdə yüksəkdir, ya da asanlıqla homogenləşmir,belə ki, toxumaların pozulması və homogenləşdirilməsi ayrı-ayrılıqda aparılmalıdır.Parçalanmanın ən etibarlı və ən məhsuldar üsulu maye azotla frezeləmə, homogenləşdirmənin ən etibarlı üsulu isə elektrik homogenizatorun istifadəsidir.Maye azotla frezeleme haqqında xüsusi qeyd: nümunə bütün frezeleme prosesi zamanı əriməməlidir, çünki endogen fermentlərin dondurulduğu zaman işləmə ehtimalı daha yüksəkdir.
Lizat seçimi
Əməliyyatın rahatlığına və qalıq endogen çirklərin faktorlarına təsir edən Ümumi istifadə edilən lizis məhlulları RNaz-ın fəaliyyətini demək olar ki, maneə törədə bilər.Buna görə də, lizis məhlulunun seçilməsinin əsas məqamı təmizlənmə üsulu ilə birlikdə nəzərə alınmasıdır.Bir istisna var:yüksək endogen ferment tərkibli nümunələrə endogen fermentləri təsirsiz hala gətirmək qabiliyyətini artırmaq üçün fenol tərkibli lizatdan istifadə etmək tövsiyə olunur.
Təmizləmə üsulunun seçimi
Qalıq endogen çirklərə təsir edən amillər, ekstraksiya sürəti Hüceyrələr kimi təmiz nümunələr üçün, demək olar ki, hər hansı bir təmizləmə üsulu ilə qənaətbəxş nəticələr əldə etmək olar.Lakin bir çox digər nümunələr, xüsusən də bitkilər, qaraciyər, bakteriya və s. kimi yüksək miqdarda çirkləri olan nümunələr üçün uyğun təmizləmə metodunun seçilməsi çox vacibdir.Sütun mərkəzdənqaçma təmizləmə üsulu sürətli bir ekstraksiya sürətinə malikdir və RNT-nin sonrakı enzimatik reaksiyasına təsir edən çirkləri effektiv şəkildə aradan qaldıra bilər, lakin bu, bahalıdır (Foregene sərfəli dəstlər təklif edə bilər, daha ətraflı məlumat üçün klikləyinburada);LiCl çöküntüsü kimi iqtisadi və klassik təmizləmə üsullarından istifadə etməklə də qənaətbəxş nəticələr əldə etmək olar, lakin əməliyyat müddəti uzundur..
RNT çıxarılması üçün "Üç İntizam və Səkkiz Diqqət"
İntizam 1:Ekzogen fermentlərin çirklənməsinə son qoyun.
Qeyd 1:Ciddi şəkildə maska və əlcək taxın.
Qeyd 2:Təcrübədə iştirak edən sentrifuqa boruları, uc başlıqları, pipet çubuqları, elektroforez çənləri və eksperimental dəzgahlar diqqətlə atılmalıdır.
Qeyd 3:Təcrübədə iştirak edən reagentlər/məhlullar, xüsusən də su RNazsız olmalıdır.
İntizam 2:Endogen fermentlərin fəaliyyətini bloklayın
Qeyd 4:Uyğun homojenləşdirmə üsulunu seçin.
Qeyd 5:Müvafiq lizat seçin.
Qeyd 6:Nümunənin başlanğıc miqdarına nəzarət edin.
İntizam 3:Çıxarış məqsədinizi aydınlaşdırın
Qeyd 7:Hər hansı bir lizat sistemi nümunənin maksimum başlanğıc miqdarına yaxınlaşdıqda, hasilatın müvəffəqiyyət dərəcəsi kəskin şəkildə azalır.
Qeyd 8:Uğurlu RNT hasilatı üçün yeganə iqtisadi meyar məhsul deyil, sonrakı təcrübələrdə uğurdur.
RNaz ilə çirklənmənin 10 ən yaxşı mənbəsi
1. Barmaqlar ekzogen fermentlərin ilk mənbəyidir, ona görə də əlcəklər geyilməli və tez-tez dəyişdirilməlidir.Bundan əlavə, maskalar da taxılmalıdır, çünki tənəffüs də fermentlərin mühüm mənbəyidir.Əlcək maskası taxmağın əlavə faydası eksperimentatoru qorumaqdır.
2. Pipet ucları, sentrifuqa boruları, pipetlər – RNaz yalnız sterilizasiya yolu ilə təsirsiz hala gətirilə bilməz, ona görə də pipet ucları və sentrifuqa boruları DEPC ilə işlənmiş kimi qeyd olunsa belə, DEPC ilə müalicə edilməlidir.Xüsusi təyinatlı pipetdən istifadə etmək yaxşıdır, istifadə etməzdən əvvəl 75% spirt pambıq topu ilə, xüsusən də çubuğu silin;əlavə olaraq, baş təmizləyicisini istifadə etməməyi unutmayın.
3. Su/tampon RNase ilə çirklənmədən təmizlənməlidir.
4. Ən azı test masası 75% spirt pambıq topları ilə silinməlidir.
5.Endogen RNase Bütün toxumalarda endogen fermentlər var, ona görə də toxumaların maye azotla tez dondurulması deqradasiyanı azaltmağın ən yaxşı yoludur.Maye azotun saxlanması/üyüdülməsi üsulu həqiqətən də əlverişsizdir, lakin bu, endogen fermentlərin yüksək səviyyədə olduğu toxumalar üçün yeganə yoldur.
6. RNT nümunələri RNT ekstraksiya məhsullarında RNaz çirklənməsinin izləri ola bilər.
7. Plazmidin çıxarılması Plazmid çıxarılması RNT-ni parçalamaq üçün tez-tez Rnase-dən istifadə edir və qalıq Rnase Proteinase K ilə həzm edilməli və PCI ilə ekstraksiya edilməlidir.
8. RNT saxlanması Hətta aşağı temperaturda saxlansa belə, iz miqdarda RNaz RNT deqradasiyasına səbəb olacaq.RNT-nin uzunmüddətli saxlanması üçün ən yaxşı həll duz/spirt suspenziyasıdır, çünki alkoqol aşağı temperaturda bütün fermentativ fəaliyyəti maneə törədir.
9. Kationlar (Ca, Mg) bu ionları ehtiva etdikdə, 80C-də 5 dəqiqə qızdırmaq RNT-nin parçalanmasına səbəb olacaq, ona görə də RNT-nin qızdırılması lazımdırsa, qoruyucu məhlulda xelatlaşdırıcı maddə (1mM Natrium Sitrat, pH 6.4) olmalıdır.
10. Sonrakı təcrübələrdə istifadə olunan fermentlər RNaz ilə çirklənə bilər.
RNT çıxarılması üçün 10 məsləhət
1: RNase fəaliyyətini tez bir zamanda qarşısını alın.Nümunələr yığıldıqdan sonra tez dondurulur və liziz zamanı sürətli əməliyyat nəticəsində RNase inaktiv edilir.
2: Yüksək ribozim tərkibli toxuma üçün uyğun ekstraksiya üsulunu seçin və yağ toxuması fenol ehtiva edən üsuldan istifadə etmək üçün ən yaxşısıdır.
3: Proqnoz keyfiyyəti Şimal tələb edir, cDNA kitabxanasının qurulması yüksək bütövlük tələb edir və RT-PCR və RPA (Ribonuclease Protection Assay) yüksək bütövlük tələb etmir.RT-PCR yüksək təmizlik tələb edir (ferment inhibitorlarının qalıqları).
4: Hərtərəfli homogenləşdirmə məhsuldarlığı yaxşılaşdırmaq və deqradasiyanı azaltmaq üçün açardır.
5: RNT elektroforezinin aşkarlanmasının bütövlüyünü yoxlayın, 28S: 18S = 2: 1 tam işarədir, 1: 1 də əksər təcrübələr üçün məqbuldur.
6: RT-PCR üçün DNT-nin çıxarılması, massiv analizi DNT-ni çıxarmaq üçün Dnase I-dən istifadə etmək yaxşıdır.
7: Ekzogen fermentlərin çirklənməsini azaldın - fermentlər xaricdən idxal edilə bilməz.
8: Aşağı konsentrasiyalı nuklein turşusunu konsentrasiya edərkən, birgə çökdürmə reagenti əlavə edilməlidir.Amma co-presipitant ehtiva edən fermentlər və DNT çirklənməsinin qarşısını almaq üçün.
9: RNT-ni yaxşıca həll edin, lazım gələrsə, 65C-də 5 dəqiqə qızdırın.
uyğun saxlama üsulu
-20C-də qısa müddətə, -80C-də isə uzun müddət saxlanıla bilər.RNT məhsuldarlığının yaxşılaşdırılmasında ilk addım müxtəlif nümunələrin RNT tərkibinin çox fərqli olduğunu başa düşməkdir.Qaraciyər, mədəaltı vəzi, ürək kimi yüksək bolluq (2-4ug/mq), beyin, embrion, böyrək, ağciyər, timus, yumurtalıq kimi orta bolluq (0,05-2ug/mq), sidik kisəsi, sümük, yağ kimi aşağı bolluq (<0,05ug/mq) mq).
1: RN-nin sərbəst buraxılması üçün hüceyrələri lize edin - RNT buraxılmasa, məhsuldarlıq azalacaq.Elektrikli homogenləşdirmə digər homogenləşdirmə üsullarından daha yaxşı işləyir, lakin maye azotun püresi, fermentativ həzm (Lizozim/Litikaza) kimi digər üsullarla da birləşdirilməlidir.
2: Çıxarma metodunun optimallaşdırılması.Fenol əsaslı üsullarla bağlı ən böyük problemlər natamam təbəqələşmə və qismən RNT itkisidir (süpernatant tamamilə çıxarıla bilməz).Natamam təbəqələşmə yüksək nuklein turşusu və zülal tərkibi ilə əlaqədardır ki, bu da istifadə olunan lizat miqdarının artırılması və ya nümunənin miqdarının azaldılması ilə həll edilə bilər.Piy toxumasına xloroformun çıxarılması mərhələsi əlavə edildi.RNT itkisi geri nasosla və ya üzvi təbəqənin çıxarılması və sonra sentrifuqa ilə azaldıla bilər.Sütun santrifüqasına əsaslanan üsullarla bağlı ən böyük problem artıq nümunədir.
Klassik ekstraksiya məsləhətləri
1. Fenolun təmizlənməsi: Bərabər həcmdə 1:1 Fenol/Xloroform əlavə edin və 1-2 dəqiqə güclü şəkildə qarışdırın.2 dəqiqə yüksək sürətlə sentrifuqa edin.Supernatantı diqqətlə çıxarın (80-90%).Heç vaxt orta təbəqəyə getməyin.Fenol/Xloroforma bərabər həcmdə reaksiya məhlulu əlavə oluna və supernatant çıxarıla bilər.Məhsuldarlığı yaxşılaşdırmaq üçün iki supernatant nuklein turşusunun çökməsi üçün birlikdə qarışdırıla bilər.Qarışdırarkən çox yumşaq olmayın və bütün supernatantı çıxarmağa çalışmayın.
2. 70-80% etanol ilə yuyulma: Yuma zamanı qalıq duzun yuyulmasını təmin etmək üçün nuklein turşusu dayandırılmalıdır.Eyni zamanda, etanol töküldükdən dərhal sonra, bir neçə saniyə yüksək sürətlə sentrifuqa edin və sonra qalıq etanolu pipetlə çıxarın.Otaq temperaturunda 5-10 dəqiqə dayandıqdan sonra həll edin.
11. Xüsusi təşkilatların çıxarılması
1. Fibröz toxuma: Ürək/skelet əzələsi kimi lifli toxumadan RNT çıxarılmasının açarı toxumanı tamamilə pozmaqdır.Bu toxumalar aşağı hüceyrə sıxlığına malikdir, buna görə də toxumanın vahid çəkisi üçün RNT miqdarı azdır və ən yaxşısı, mümkün qədər çox başlanğıc miqdarı istifadə etməkdir.Dondurma şəraitində toxumanı hərtərəfli üyütməyinizə əmin olun.
2. Zülal/yağ tərkibi yüksək olan toxumalar: beyin/bitki yağının tərkibi yüksəkdir.PCI ekstraksiyasından sonra supernatant ağ flokulyarları ehtiva edir.Supernatant xloroformla yenidən ekstraksiya edilməlidir.
3. Yüksək nuklein turşusu/ribozim tərkibli toxumalar: dalaq/timus yüksək nuklein turşusu və ribozim tərkibinə malikdir.Dondurma şəraitində toxumaların üyüdülməsi və ardınca sürətli homogenləşmə ribozimləri effektiv şəkildə təsirsiz hala gətirə bilər.Bununla belə, lizat çox özlüdürsə (yüksək nuklein turşusu tərkibinə görə), PCI ekstraktı effektiv şəkildə təbəqələşə bilməyəcək;daha çox lizat əlavə etmək bu problemi həll edə bilər.Çoxlu PCI ekstraksiyaları daha çox qalıq DNT çıxara bilər.Əgər spirt əlavə edildikdən dərhal sonra ağ çöküntü əmələ gəlirsə, bu, DNT-nin çirklənməsini göstərir.Həll edildikdən sonra turşulu PCI ilə yenidən ekstraksiya DNT çirklənməsini aradan qaldıra bilər.
4. Bitki toxuması: Bitki toxuması heyvan toxumasından daha mürəkkəbdir.Ümumiyyətlə, bitkilər maye azot şəraitində üyüdülür, ona görə də endogen fermentlər tərəfindən RNT deqradasiyası nadirdir.Deqradasiya problemi həll olunmazsa, bu, demək olar ki, nümunənin tərkibindəki çirklərdən qaynaqlanır.Bir çox bitkilərin tərkibində olan çirklər qalıqlara gətirib çıxaracaq və qalıqların səbəbi çox vaxt bu çirklərin RNT ilə bəzi oxşarlıqlara malik olmasıdır: siz çökdürürsünüz və mən çökürəm, siz adsorbsiya edirəm və mən adsorbsiyam.Bu xüsusiyyətlər onların çox güclü ferment inhibitorları olduğunu müəyyən edir.
Hal-hazırda kommersiya RNT ekstraksiya reagentləri kiçik düzəlişlərlə demək olar ki, bütün heyvan toxumalarına uyğunlaşdırıla bilər, lakin əksər bitki toxumaları üçün uyğun ola bilən kommersiya RNT ekstraksiya reagentləri azdır.Xoşbəxtlikdən, Foregene xüsusi təmin edə bilərbitki RNT ekstraksiya dəstləri, bizdə varBitki Ümumi RNT İzolyasiya dəsti, Bitki Total RNT İzolyasiya dəsti Plus.Sonuncu xüsusi olaraq yüksək polisaxarid və polifenol tərkibli bitkilər üçün nəzərdə tutulmuşdur.RNT hasilatı üçün laboratoriya istifadəçilərinin rəyi xüsusilə yaxşıdır.
12. Nümunənin dondurulması və əriməsinin təsiri Dondurulmuş nümunə daha böyük ola bilər və RNT ekstraksiyası üçün istifadə edilməzdən əvvəl onu kəsmək lazımdır.Nümunələr kəsmə zamanı əriməyə meyllidir (bəlkə də qismən).Dondurulmuş nümunələrin RNT çıxarılmasından əvvəl çəkilməsinə ehtiyac ola bilər və bu proses zamanı ərimə mütləq baş verəcəkdir.Bəzən nümunənin əriməsi maye azot frezeleme prosesi zamanı da baş verir;və ya dondurulmuş nümunə maye azot frezesi olmadan birbaşa lizata əlavə edilir və tam homogenləşmədən əvvəl ərimə mütləq baş verəcəkdir.Təcrübələr göstərdi ki, dondurulmuş toxuma ərimə zamanı RNT deqradasiyasına təzə toxuma nisbətən daha çox meyllidir.Ehtimal olunan səbəb: Dondurma-ərimə prosesi hüceyrə daxilindəki strukturları pozur və endogen fermentlərin RNT ilə birbaşa təmasda olmasını asanlaşdırır.
13. RNT keyfiyyətinin mühakiməsi Adətən, elektroforez RNT-nin bütövlüyünü mühakimə etmək üçün, A260/A280 isə RNT-nin saflığını qiymətləndirmək üçün istifadə olunur.Teorik olaraq, bütöv RNT 28S:18S = 2.7:1 nisbətinə malikdir və əksər məlumatlar 28S:18S = 2:1 nisbətini vurğulayır.Fakt budur ki, hüceyrələrdən başqa nümunələrdən çıxarılan RNT-nin demək olar ki, heç biri 2:1 nisbətində deyil (bu, Agilent Bioanalyzer istifadə edərək əldə edilmişdir).
RNT-nin elektroforez nəticələrinə bir çox amillər, o cümlədən ikincili struktur, elektroforez şəraiti, nümunə yükü, EB ilə doyma dərəcəsi və s. təsir göstərir. RNT-ni aşkar etmək üçün yerli elektroforezdən istifadə edin və nəzarət kimi DNT Markerindən istifadə edin.2kb-də 28S və 0.9kb-da 18S aydındırsa və 28S: 18S > 1 olarsa, bütünlük sonrakı təcrübələrin əksəriyyətinin tələblərinə cavab verə bilər.
A260/A280 çox qarışıqlığa səbəb olan göstəricidir.İlk növbədə, nuklein turşuları üçün bu göstəricinin orijinal mənasını aydınlaşdırmaq lazımdır: təmiz RNT, onun A260/280 = təxminən 2.0.Saf RNT “səbəb” və A260/A280 = 2 “təsir”dir.İndi hər kəs A260/A280-dən “səbəb” olaraq istifadə edir və “əgər A260/A280 = 2, deməli RNT təmizdir” deyə düşünür, bu da təbii olaraq çaşqınlığa səbəb olur.
Əgər maraqlanırsınızsa, fenol, guanidin izotiosiyanat, PEG və s. kimi ekstraksiyada tez-tez istifadə olunan bir az reagenti RNT nümunənizə əlavə edə və sonra A260/A280 nisbətini ölçə bilərsiniz.Reallıq ondan ibarətdir ki, RNT hasilatı üçün istifadə edilən bir çox reagentlər, eləcə də nümunədəki bir çox çirklər A260/A280-ə təsir edərək A260 və A280 ətrafında udurlar.
Hazırda ən ibrətamiz yanaşma 200-300 nm diapazonunda RNT nümunələrinin skan edilməsidir.Saf RNT əyrisi aşağıdakı xüsusiyyətlərə malikdir: əyri hamardır, A230 və A260 iki əyilmə nöqtəsidir, A300 0-a yaxındır, A260/A280 = təxminən 2.0 və A260/A230 = təxminən 2.0.Skan məlumatları mövcud deyilsə, A260/A230 nisbəti də müəyyən edilməlidir, çünki bu nisbət fermentativ reaksiyaya təsir edən bütün çirklərin ötürülməsinə daha həssasdır.Cihazın xətti diapazonunu nəzərə alın (A260 üçün 0,1–0,5).
Digər iki faydalı hadisə var: A260/A280 suda ölçüldükdə nisbət təxminən 0,3 az olacaq;10 mM EDTA-da ölçülən nisbət isə 1 mM EDTA-da ölçülən nisbətdən təxminən 0,2 yüksəkdir.
Əlaqədar məhsullar:
Çin Bitki Ümumi RNT İzolyasiya Kiti İstehsalçı və Təchizatçısı |Foregene (foreivd.com)
RNT izolyasiya seriyası – Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)
Göndərmə vaxtı: 15 iyul 2022-ci il
