Astar dizayn əsası (99% problemlər həll edilə bilər)
1. Primer uzunluğu: Dərslik 15-30bp, adətən təxminən 20bp tələb edir.Həqiqi vəziyyət spesifikliyi təmin etmək üçün 18-24bp olmaq daha yaxşıdır, lakin daha uzun, daha yaxşı, çox uzun primer də spesifikliyi azaldacaq və məhsuldarlığı azaldacaq.
2. Primer gücləndirmə aralığı: 200-500bp uyğundur və xüsusi şərtlər altında fraqment 10kb-ə qədər genişləndirilə bilər.
3. Primer bazası: G+C-nin tərkibi 40-60% olmalıdır, çox az G+C gücləndirmə effekti yaxşı deyil, çox G+C qeyri-spesifik zolaqlar görünmək asandır.ATGC ən yaxşı şəkildə 5-dən çox purin və ya pirimidin nukleotidindən ibarət qruplardan qaçaraq təsadüfi şəkildə paylanır.Stabilliyi artırmaq üçün 5′ ucu və ara ardıcıllıqlar üçün multi-gc, 3′ sonunda zəngin GC-dən qaçın, son 3 əsas üçün GC və ya son 5 əsasdan 3-ü üçün GC yoxdur.
4. Primerlərdə ikincil quruluşdan qaçın və iki primer arasında tamamlamadan, xüsusən 3 'ucunda tamamlamadan qaçın, əks halda primer dimer əmələ gələcək və qeyri-spesifik gücləndirilmiş zolaqlar yaranacaq.
5. Primerlərin 3 'ucundakı əsaslar, xüsusən də sonuncu və sondan əvvəlki əsaslar, qoşalaşdırılmamış terminal əsaslara görə PCR uğursuzluğunun qarşısını almaq üçün ciddi şəkildə qoşalaşdırılmalıdır.
6. Primerlər müvafiq parçalanma sahələrinə malikdir və ya əlavə edilə bilər və gücləndirilmiş hədəf ardıcıllığı, tercihen, parçalanma təhlili və ya molekulyar klonlaşdırma üçün çox faydalı olan uyğun parçalanma sahələrinə malik olmalıdır.
7. Primerlərin spesifikliyi: primerlərin nuklein turşusu ardıcıllığı verilənlər bazasında digər ardıcıllıqla aşkar homologiyası olmamalıdır.
8. Proqram təminatından istifadə etməyi öyrənin: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Bu onlayn dizayn ən yaxşı işləyir).
Yuxarıdakı məzmun primer dizayn problemlərinin ən azı 99% həll edə bilər.
Astar dizaynının detallarına nəzarət edin
1. Astarın uzunluğu
Ümumi astar uzunluğu 18 ~ 30 əsasdır.Ümumiyyətlə, astarın yumşalma temperaturunu təyin edən ən vacib amil astarın uzunluğudur.Astarın yumşalma temperaturu ümumiyyətlə seçilir (Tm dəyəri -5℃) və bəziləri birbaşa Tm dəyərindən istifadə edir.Astarların yumşalma temperaturunu təxmini hesablamaq üçün aşağıdakı düsturlardan istifadə edilə bilər.
Astarın uzunluğu 20bp-dən az olduqda: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Astarın uzunluğu 20bp-dən çox olduqda: 62,3℃+0,41℃(%GC)-500/uzunluq-5℃
Bundan əlavə, tavlama temperaturunu hesablamaq üçün bir çox proqram da istifadə edilə bilər, hesablama prinsipi fərqli olacaq, buna görə də bəzən hesablanmış dəyər kiçik bir boşluq ola bilər.PCR reaksiyalarını optimallaşdırmaq üçün ən yaxşı effektivlik və spesifiklik üçün 54℃-dən az olmayan tavlama temperaturunu təmin edən ən qısa primerlərdən istifadə edilir.
Ümumilikdə, primer spesifikliyi hər bir əlavə nukleotid üçün dörd dəfə artır, belə ki, əksər tətbiqlər üçün minimum primer uzunluğu 18 nukleotiddir.Astar uzunluğunun yuxarı həddi çox vacib deyil, əsasən reaksiya səmərəliliyi ilə bağlıdır.Entropiyaya görə, primer nə qədər uzun olsa, DNT polimerazanın bağlanması üçün sabit ikiqat zəncirli şablon yaratmaq üçün hədəf DNT-yə bağlanma sürəti bir o qədər aşağı olar.
Primerlərin dizaynı üçün proqram təminatından istifadə edərkən, primerlərin uzunluğu öz növbəsində TM dəyəri ilə müəyyən edilə bilər, xüsusilə də flüoresan kəmiyyət PCR primerləri üçün TM=60℃ və ya daha çox nəzarət edilməlidir.
2.GC məzmunu
Ümumiyyətlə, primer ardıcıllıqlarında G+C tərkibi 40%~60% təşkil edir və bir cüt primerin GC məzmunu və Tm dəyəri əlaqələndirilməlidir.Əgər primer ciddi GC və ya AT meylinə malikdirsə, müvafiq miqdarda A, T və ya G və C quyruğu primerin 5 'ucuna əlavə edilə bilər.
3. Qızdırma temperaturu
Yuvlama temperaturu zəncirdən çıxarılan temperaturdan 5 ℃ aşağı olmalıdır.Primer əsaslarının sayı azdırsa, tavlama temperaturu müvafiq olaraq artırıla bilər ki, bu da PCR-nin spesifikliyini artıra bilər.Bazaların sayı çox olarsa, yumşalma temperaturu müvafiq olaraq azaldıla bilər.Bir cüt primer arasındakı 4℃ ~ 6℃ yumşalma temperaturu fərqi PCR məhsuldarlığına təsir etməyəcək, lakin ideal olaraq bir cüt primerin yumşalma temperaturu eynidir, bu da 55℃ ~ 75℃ arasında dəyişə bilər.
4. Gücləndirmə şablonunun ikinci dərəcəli struktur sahəsindən çəkinin
Gücləndirilmiş fraqmenti seçərkən şablonun ikinci dərəcəli struktur bölgəsindən qaçınmaq daha yaxşıdır.Hədəf fraqmentinin sabit ikinci dərəcəli strukturu şablon seçimi üçün faydalı olan müvafiq kompüter proqramı ilə proqnozlaşdırıla və qiymətləndirilə bilər.Eksperimental nəticələr göstərir ki, genişləndiriləcək bölgənin sərbəst enerjisi (△G) 58,6 kJ/mol-dan az olduqda genişlənmə çox vaxt uğursuz olur.
5. Hədəf DNT ilə uyğunsuzluq
Gücləndirilmiş hədəf DNT ardıcıllığı böyük olduqda, bir primer hədəf DNT-nin bir çox hissəsinə bağlana bilər və nəticədə çoxlu lentlər görünə bilər.Bu dəfə BLAST proqram testindən istifadə etmək lazımdır, vebsayt:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.İki ardıcıllığı align seçin (bl2seq).
Primer ardıcıllıqlarını 1-ci zonaya və hədəf DNT ardıcıllıqlarını zona 2-yə yapışdırmaq bir-birini əvəz edir və BLAST tamamlayıcı, antisens və digər imkanları hesablayır, beləliklə istifadəçilərin hər iki zəncirin hiss zəncirləri olub-olmadığını fərq etməsinə ehtiyac yoxdur.Siz həmçinin verilənlər bazasında ardıcıllığın GI nömrəsini bilirsinizsə, GI nömrəsini daxil edə bilərsiniz, beləliklə ardıcıllığın böyük bir hissəsini yapışdırmaq lazım deyil.Nəhayət, primerin hədəf DNT-də çoxlu homoloji sahələrin olub-olmadığını görmək üçün 3-də Align düyməsini klikləyin.
6. Astar terminalı
Astarın 3 'ucu uzantının başladığı yerdir, ona görə də uyğunsuzluqların orada başlamasının qarşısını almaq vacibdir.3 'sonu 3 ardıcıl G və ya C-dən çox olmamalıdır, çünki bu, primerin G+C zənginləşdirmə ardıcıllığı bölgəsində səhvən işə salınmasına səbəb olacaq.Xüsusi PCR (AS-PCR) reaksiyaları istisna olmaqla, 3 'ucu heç bir ikincil quruluş yarada bilməz, primerin 3' ucu uyğunlaşa bilməz.Məsələn, kodlaşdırma bölgəsi gücləndirilirsə, primerin 3 'ucu kodonun üçüncü mövqeyində dayandırılmamalıdır, çünki kodonun üçüncü mövqeyi degenerasiyaya meyllidir, bu da gücləndirmənin spesifikliyinə və səmərəliliyinə təsir edəcəkdir.Əlavə primerlərdən istifadə edərkən, kodon istifadə cədvəlinə baxın, bioloji üstünlüklərə diqqət yetirin, 3′ ucunda əlavə primerlərdən istifadə etməyin və daha yüksək konsentrasiyalı primerlərdən (1uM-3uM) istifadə edin.
7. Astarların ikinci dərəcəli quruluşu
Astarların özləri tamamlayıcı ardıcıllığa malik olmamalıdırlar, əks halda astarların özləri saç sancağı strukturlarına büküləcək və bu ikinci dərəcəli quruluş sterik maneə səbəbindən astarların və şablonların bağlanmasına təsir edəcəkdir.Süni mühakimə istifadə edilərsə, primerlərin özlərinin davamlı tamamlayıcı əsasları 3bp-dən çox olmamalıdır.İki primer arasında heç bir tamamlayıcılıq olmamalıdır, xüsusilə primer dimerlərinin əmələ gəlməsinin qarşısını almaq üçün 3 'ucunun tamamlayıcı üst-üstə düşməsindən qaçınmaq lazımdır.Ümumiyyətlə, bir cüt primer arasında 4-dən çox ardıcıl əsas homologiyası və ya tamamlayıcılığı olmamalıdır.
8. Markerlər və ya yerlər əlavə edin
5 'sonu gücləndirmə spesifikliyinə az təsir göstərir və buna görə də gücləndirmə spesifikliyinə təsir etmədən dəyişdirilə bilər.5-ci primerin modifikasiyasına aşağıdakılar daxildir: ferment məhdudlaşdırma sahəsinin əlavə edilməsi;Etiketli biotin, flüoresan, digoksin, Eu3+ və s. Protein bağlayan DNT ardıcıllığını təqdim edin;Mutasiya sahələrinin təqdim edilməsi, mutasiya ardıcıllığının daxil edilməsi və buraxılması və promotor ardıcıllığının tətbiqi və s. Əlavə əsaslar gücləndirmənin səmərəliliyinə az və ya çox təsir edəcək və primer dimerinin formalaşması şansını artıracaq, lakin növbəti addım üçün bəzi güzəştlər edilməlidir.Məhdudiyyət yerləri və promotor ardıcıllıqları kimi hədəf ardıcıllıqda mövcud olmayan əlavə ardıcıllıqlar spesifikliyə təsir etmədən primerin 5′ ucuna əlavə edilə bilər.Bu ardıcıllıqlar primer Tm qiymətlərinin hesablanmasına daxil edilmir, lakin tamamlayıcılıq və daxili ikinci dərəcəli struktur üçün sınaqdan keçirilməlidir.
9. Alt klonlar
Çox vaxt, PCR yalnız ilkin klonlaşdırmadır və sonra biz hədəf fraqmenti müxtəlif vektorlara subklonlaşdırmalıyıq, ona görə də PCR addımında növbəti əməliyyat üçün əlavə əsaslar hazırlamalıyıq.
Subklonlaşdırma üçün nəzərdə tutulmuş bəzi ardıcıllıqlar aşağıda ümumiləşdirilmişdir.
Məhdudiyyət endonükleaz məhdudlaşdırma sahəsi əlavə edildi
Ferment məhdudlaşdırma sahələrinin əlavə edilməsi PCR məhsullarının subklonlaşdırılması üçün ən çox istifadə edilən üsuldur.Ümumiyyətlə, dekolte sahəsi altı əsasdır, 5 'sonuna əlavə olaraq dekolte sahəsinə 2 ~ 3 qoruyucu baza əlavə etmək lazımdır.Bununla belə, müxtəlif fermentlərin tələb etdiyi qoruyucu əsasların sayı fərqlidir.Məsələn, SalⅠ qoruyucu baza tələb etmir, EcoRⅤ 1 qoruyucu baza tələb edir, NotⅠ 2 qoruyucu əsas tələb edir və Hind Ⅲ üçün 3 qoruyucu baza tələb olunur.
LIC quyruğu əlavə edir
LIC-nin tam adı Ligation-Independent klonlaşdırmadır, Navogen tərəfindən xüsusi olaraq pET vektorunun bir hissəsi üçün icad edilmiş klonlama üsuludur.LIC metodu ilə hazırlanmış pET daşıyıcısı tamamlayıcı olmayan 12-15 əsaslı tək zəncirli yapışqan uclara malikdir və bu, hədəf daxiletmə fraqmentində müvafiq yapışqan ucları tamamlayır.Gücləndirmə məqsədləri üçün daxil edilmiş fraqmentin primer 5′ ardıcıllığı LIC vektorunu tamamlamalıdır.T4 DNT polimerazının 3′→5′ ekstranekt aktivliyi qısa müddətdən sonra daxil edilmiş fraqmentdə tək zəncirli yapışqan uc əmələ gətirə bilər.Məhsul yalnız hazırlanmış insert parçası ilə vektorun qarşılıqlı tavlanmasından əmələ gələ bildiyi üçün bu üsul çox sürətli və səmərəlidir və yönləndirilmiş klonlamadır.
Yönləndirilmiş TA klonu əlavə quyruq
TA klonlaması fraqmenti vektora yönəldə bilmədi, buna görə də daha sonra Invitrogen bir ucunda dörd əsas GTGGS olan klonlamağı hədəf ala bilən vektor təqdim etdi.Buna görə də, PCR primerlərinin dizaynında, fraqmentlərin "yönümlü" olması üçün tamamlayıcı ardıcıllıqlar əlavə edilməlidir.
Əgər vaxtınız azdırsa, geni vektorla birləşdirərək birbaşa sintezi sınaya bilərsiniz ki, bu da biz musecularistlərdə ET gen sintezi deyirik.
D. In-Fusion klonlaşdırma üsulu
Ligaza tələb olunmur, uzun reaksiya tələb olunmur.Nə qədər ki, xəttiləşdirilmiş vektorun hər iki ucunda ardıcıllıq astarların dizaynında tətbiq edilir, sonra PCR məhsulu və xəttiləşdirilmiş vektor BSA olan in-fusion ferment məhluluna əlavə edilir və otaq temperaturunda yarım saat yerləşdirilir, transformasiya həyata keçirilə bilər.Bu üsul xüsusilə böyük həcmli çevrilmə üçün uyğundur.
10. Astarı birləşdirin
Bəzən, primer dizaynı haqqında yalnız məhdud ardıcıllıq məlumatları məlumdur.Məsələn, yalnız amin turşusu ardıcıllığı məlumdursa, birləşdirici primer dizayn edilə bilər.Birləşmə primeri tək bir amin turşusunu kodlayan bütün müxtəlif baza imkanlarını təmsil edən müxtəlif ardıcıllığın qarışığıdır.Spesifikliyi artırmaq üçün müxtəlif orqanizmlərin əsas istifadə üstünlüklərinə uyğun olaraq əlavəni azaltmaq üçün kodon istifadə cədvəlinə müraciət edə bilərsiniz.Astarın yumşalma temperaturunu azaltmaq üçün hipoksantin bütün əsaslarla birləşdirilə bilər.Astarın 3′ ucunda əlavə edilmiş əsaslardan istifadə etməyin, çünki 3′ ucunda son 3 əsasın qızdırılması PCR-ni səhv yerdə başlamaq üçün kifayətdir.Daha yüksək primer konsentrasiyaları (1μM - 3μM) istifadə olunur, çünki bir çox əlavə qarışıqlardakı primerlər hədəf şablona xas deyildir.
PCR xammalınəzarət
1. Astarın miqdarı
Hər bir primerin konsentrasiyası 0,1 ~ 1umol və ya 10 ~ 100pmol təşkil edir.Tələb olunan nəticəni ən az miqdarda astarla əldə etmək daha yaxşıdır.Astarın yüksək konsentrasiyası uyğunsuzluğa və qeyri-spesifik gücləndirməyə səbəb olacaq və primerlər arasında dimerlərin əmələ gəlməsi şansını artıracaq.
2. Primer konsentrasiyası
Primerlərin konsentrasiyası spesifikliyə təsir göstərir.Optimal primer konsentrasiyası ümumiyyətlə 0,1 ilə 0,5μM arasındadır.Daha yüksək primer konsentrasiyası qeyri-spesifik məhsulların gücləndirilməsinə səbəb olur.
3. Astarın yumşalma temperaturu
Astarlar üçün digər vacib parametr ərimə temperaturudur (Tm).Bu, primerlərin və tamamlayıcı ardıcıllığın 50%-nin ikiqat zəncirli DNT molekulları kimi təqdim edildiyi temperaturdur.PCR tavlama temperaturunu təyin etmək üçün Tm tələb olunur.İdeal olaraq, yumşalma temperaturu primerlərin hədəf ardıcıllıqla effektiv qızdırılmasını təmin etmək üçün kifayət qədər aşağıdır, lakin qeyri-spesifik bağlanmanı azaltmaq üçün kifayət qədər yüksəkdir.55 ℃ ilə 70 ℃ arasında məqbul yumşalma temperaturu.Yuyulma temperaturu ümumiyyətlə primerin Tm-dən 5℃ aşağı təyin edilir.
İstifadə olunan düsturdan və primerlərin ardıcıllığından asılı olaraq, Tm-nin təyin edilməsi üçün bir neçə düstur var.Əksər düsturlar təxmini Tm dəyərini təmin etdiyinə görə bütün yumşalma temperaturları yalnız başlanğıc nöqtəsidir.Xüsusiyyət, yumşalma temperaturunu tədricən yüksəldən bir neçə reaksiyanın təhlili ilə yaxşılaşdırıla bilər.Təxmini Tm-5℃-dən aşağı başlayın və yumşalma temperaturunu 2℃ artımla tədricən artırın.Daha yüksək tavlama temperaturu primer dimerlərinin və qeyri-spesifik məhsulların meydana gəlməsini azaldacaq.Ən yaxşı nəticələr üçün iki primer təxmini Tm dəyərlərinə malik olmalıdır.Primer cütlərinin Tm fərqi 5 ℃-dən çox olarsa, astarlar dövrədə daha aşağı yumşalma temperaturundan istifadə edərək əhəmiyyətli yanlış başlanğıc göstərəcəklər.İki primer Tm fərqlidirsə, yumşalma temperaturunu ən aşağı Tm-dən 5℃ aşağı təyin edin.Alternativ olaraq, spesifikliyi artırmaq üçün əvvəlcə daha yüksək Tm üçün nəzərdə tutulmuş yumşalma temperaturlarında beş dövrə, daha sonra isə daha aşağı Tm üçün nəzərdə tutulmuş yumşalma temperaturlarında qalan dövrlər yerinə yetirilə bilər.Bu, sıx şəraitdə təyinat şablonunun qismən surətini əldə etməyə imkan verir.
4. Astarın təmizliyi və sabitliyi
Fərdi primerlərin standart təmizliyi əksər PCR tətbiqləri üçün adekvatdır.Benzoil və izobutilil qruplarının duzsuzlaşdırma yolu ilə çıxarılması minimaldır və buna görə də PCR-ə müdaxilə etmir.Bəzi proqramlar sintez prosesində tam olmayan ardıcıllığı aradan qaldırmaq üçün təmizlənmə tələb edir.Bu kəsilmiş ardıcıllıqlar DNT sintezi kimyasının effektivliyi 100% olmadığı üçün baş verir.Bu, DNT-ni 3′-dən 5′-ə qədər yaratmaq üçün hər bir baza əlavə edildikdə təkrar kimyəvi reaksiyalardan istifadə edən dairəvi bir prosesdir.Hər iki dövrədə uğursuz ola bilərsiniz.Daha uzun primerlər, xüsusən də 50 əsasdan çox olanlar, kəsilmiş ardıcıllığın böyük bir hissəsinə malikdir və təmizlənmə tələb edə bilər.
Astarların məhsuldarlığına sintetik kimya və təmizləmə metodunun səmərəliliyi təsir göstərir.Sitologiya və Shengong kimi biofarmasevtik şirkətlərin hamısı oliqonukleozidin ümumi istehsalını təmin etmək üçün minimum OD vahidindən istifadə edirlər.Xüsusi astarlar quru toz şəklində göndərilir.Son konsentrasiyanın 100μM olması üçün primerləri TE-də yenidən həll etmək yaxşıdır.TE deionlaşdırılmış sudan daha yaxşıdır, çünki suyun pH-ı çox vaxt turşudur və oliqonukleozidlərin hidrolizinə səbəb olur.
Astarların sabitliyi saxlama şəraitindən asılıdır.Quru toz və həll olunmuş primerlər -20 ℃ temperaturda saxlanmalıdır.TE-də 10μM-dən çox konsentrasiyalarda həll olunan primerlər -20℃ temperaturda 6 ay stabil saxlanıla bilər, lakin yalnız otaq temperaturunda (15℃ ilə 30℃) 1 həftədən az müddətə saxlanıla bilər.Quru toz astarları -20 C-də ən azı 1 il, otaq temperaturunda (15 C - 30 C) 2 aya qədər saxlanıla bilər.
5. Fermentlər və onların konsentrasiyası
Hazırda istifadə edilən Taq DNT polimerazı əsasən koliform bakteriyalar tərəfindən sintez edilən gen mühəndisliyi fermentidir.Tipik bir PCR reaksiyasını kataliz etmək üçün lazım olan fermentin miqdarı təxminən 2,5 U (100ul-lik ümumi reaksiya həcminə aiddir).Konsentrasiya çox yüksək olarsa, bu, qeyri-spesifik gücləndirməyə səbəb ola bilər;konsentrasiya çox aşağı olarsa, sintetik məhsulun miqdarı azalacaq.
6. dNTP-nin keyfiyyəti və konsentrasiyası
dNTP-nin keyfiyyəti PCR gücləndirilməsinin konsentrasiyası və effektivliyi ilə sıx bağlıdır.dNTP tozu dənəvərdir və düzgün saxlanmadıqda dəyişkənliyi bioloji aktivliyini itirir.dNTP məhlulu asidikdir və yüksək konsentrasiyada, PH-nı 7,0 ~ 7,5-ə tənzimləmək üçün 1M NaOH və ya 1M Tris.HCL bufer məhlulu ilə, az miqdarda alt qablaşdırma, -20 ℃ temperaturda dondurulmuş saxlama şəraitində istifadə edilməlidir.Çoxlu dondurma-ərimə dNTP-ni pisləşdirəcək.PCR reaksiyasında dNTP 50 ~ 200umol/L olmalıdır.Xüsusilə dörd DNTPS konsentrasiyasına diqqət yetirilməlidir (bərabər mol hazırlığı).Əgər onlardan hər hansı birinin konsentrasiyası digərlərindən fərqlidirsə (daha yüksək və ya aşağı), uyğunsuzluq yaranacaq.Çox aşağı konsentrasiya PCR məhsullarının məhsuldarlığını azaldacaq.dNTP Mg2+ ilə birləşə və sərbəst Mg2+ konsentrasiyasını azalda bilər.
7. Şablon (hədəf gen) nuklein turşusu
Şablon nuklein turşusunun miqdarı və təmizlənmə dərəcəsi PCR-nin müvəffəqiyyəti və ya uğursuzluğu üçün əsas bağlantılardan biridir.Ənənəvi DNT təmizləmə üsulları adətən nümunələri həzm etmək və atmaq üçün SDS və proteaz K istifadə edir.SDS-nin əsas funksiyaları bunlardır: hüceyrə membranında lipidləri və zülalları həll edir, beləliklə, membran zülallarını həll etməklə hüceyrə membranını məhv edir və hüceyrədə nüvə zülallarını dissosiasiya edir, SDS də zülallarla birləşə və çökə bilər;Proteaz K zülalları, xüsusən də DNT ilə əlaqəli histonları hidrolizə və həzm edə bilər, sonra zülalları və digər hüceyrə komponentlərini çıxarmaq üçün üzvi həlledici fenol və xloroformdan istifadə edir və nuklein turşusunu çökdürmək üçün etanol və ya izopropil spirtindən istifadə edir.Çıxarılan nuklein turşusu PCR reaksiyaları üçün şablon kimi istifadə edilə bilər.Ümumi klinik aşkarlama nümunələri üçün hüceyrələri həll etmək, patogenləri lizatlaşdırmaq, zülalları xromosomlardan azad hədəf genlərə həzm etmək və çıxarmaq üçün sürətli və sadə üsuldan istifadə edilə bilər və birbaşa PCR gücləndirilməsi üçün istifadə edilə bilər.RNT şablonunun çıxarılması adətən RNaz-ın RNT-nin parçalanmasının qarşısını almaq üçün guanidin izotiyosiyanat və ya proteaz K metodundan istifadə edir.
8.Mg2+ konsentrasiyası
Mg2+ PCR gücləndirilməsinin spesifikliyinə və məhsuldarlığına əhəmiyyətli təsir göstərir.Ümumi PCR reaksiyasında müxtəlif dNTP-lərin konsentrasiyası 200umol/L olduqda, müvafiq Mg2+ konsentrasiyası 1,5 ~ 2,0 mmol/L-dir.Mg2+ konsentrasiyası çox yüksəkdir, reaksiyanın spesifikliyi azalır, qeyri-spesifik amplifikasiya baş verir, çox aşağı konsentrasiya Taq DNT polimerazanın aktivliyini azaldacaq, nəticədə reaksiya məhsulları azalacaq.
Maqnezium ionları PCR-nin bir neçə aspektinə təsir göstərir, məsələn, məhsuldarlığa təsir edən DNT polimeraz fəaliyyəti;Başqa bir nümunə, spesifikliyə təsir edən primer tavlanmasıdır.dNTP və şablon maqnezium ionuna bağlanaraq fermentin fəaliyyəti üçün tələb olunan sərbəst maqnezium ionunun miqdarını azaldır.Optimal maqnezium ionunun konsentrasiyası müxtəlif primer cütləri və şablonları üçün dəyişir, lakin 200μM dNTP ilə tipik PCR başlanğıc konsentrasiyası 1.5mM-dir (qeyd: real vaxt kəmiyyət PCR üçün flüoresan zond ilə 3-5mM maqnezium ion məhlulu istifadə edin).Sərbəst maqnezium ionlarının daha yüksək konsentrasiyası məhsuldarlığı artırır, eyni zamanda qeyri-spesifik gücləndirməni artırır və sədaqəti azaldır.Optimal konsentrasiyanı müəyyən etmək üçün maqnezium ionunun titrləmələri 1 mM-dən 3 mM-ə qədər 0,5 mM artımla aparıldı.Maqnezium ionunun optimallaşdırılmasından asılılığı azaltmaq üçün Platinum Taq DNT polimerazından istifadə edilə bilər.Platinum Taq DNT polimerazı Taq DNT polimeraza nisbətən daha geniş diapazonlu maqnezium ion konsentrasiyaları üzərində funksiyanı qoruya bilir və buna görə də daha az optimallaşdırma tələb edir.
9. Pcr-i təşviq edən əlavələr
Yuvlama temperaturunun, primer dizaynının və maqnezium ionunun konsentrasiyasının optimallaşdırılması əksər şablonların yüksək spesifik gücləndirilməsi üçün kifayətdir;lakin bəzi şablonlar, o cümlədən yüksək GC məzmunlu şablonlar əlavə tədbirlər tələb edir.DNT-nin ərimə temperaturuna təsir edən əlavələr məhsulun spesifikliyini və məhsuldarlığını yaxşılaşdırmaq üçün başqa bir yol təqdim edir.Ən yaxşı nəticələr üçün şablonun tam denatürasiyası tələb olunur.
Bundan əlavə, ikincil quruluş primerin bağlanmasına və fermentin uzanmasına mane olur.
Formamid, DMSO, qliserin, betain və PCRx Gücləndirici Məhlul daxil olmaqla PCR əlavələri gücləndirməni gücləndirir.Onların mümkün mexanizmi ərimə temperaturunu azaltmaq, beləliklə, primerlərin tavlanmasına kömək etmək və ikincil struktur bölgəsi vasitəsilə DNT polimerazının uzanmasına kömək etməkdir.PCRx Solution başqa üstünlüklərə malikdir.Platinum Taq DNT polimeraza və Platinum Pfx DNT polimeraza ilə istifadə edildikdə minimum maqnezium ionunun optimallaşdırılması tələb olunur.Beləliklə, Platinum texnikası üçüncü yanaşmanın, maqnezium ionunun optimallaşdırılmasından asılılığı azaltmaqla spesifikliyi artırmaq üçün əlavə ilə birləşdirilir.Ən yaxşı nəticələr üçün əlavələrin konsentrasiyası optimallaşdırılmalıdır, xüsusən də Taq DNT polimerazını maneə törədən DMSO, formamid və qliserol.
10. İsti başlanğıc
İsti başlanğıc PCR, yaxşı primer dizaynına əlavə olaraq, PCR spesifikliyini yaxşılaşdırmaq üçün ən vacib üsullardan biridir.Taq DNT polimerazının optimal uzanma temperaturu 72 ℃ olsa da, polimeraza otaq temperaturunda aktiv qalır.Beləliklə, qeyri-spesifik məhsullar PCR reaksiyasının hazırlanması zamanı və istilik dövrünün başlanğıcında saxlama temperaturu tavlama temperaturundan aşağı olduqda istehsal olunur.Yarandıqdan sonra bu qeyri-spesifik məhsullar effektiv şəkildə gücləndirilir.İsti başlanğıc PCR, primer dizaynı üçün istifadə edilən sahələr genetik elementlərin yeri ilə məhdudlaşdıqda, məsələn, sahəyə yönəldilmiş mutasiyalar, ekspressiyanın klonlaşdırılması və ya DNT mühəndisliyi üçün istifadə edilən genetik elementlərin qurulması və manipulyasiyası ilə məhdudlaşdıqda xüsusilə təsirlidir.
Taq DNT polimerazanın fəaliyyətini məhdudlaşdırmaq üçün ümumi üsul buz üzərində PCR reaksiya məhlulu hazırlamaq və onu əvvəlcədən qızdırılan PCR aparatına yerləşdirməkdir.Bu üsul sadə və ucuzdur, lakin o, fermentin fəaliyyətini tamamlamır və buna görə də qeyri-spesifik məhsulların gücləndirilməsini tamamilə aradan qaldırmır.
Termal astarlama, PCR aparatı denatürasiya temperaturuna çatana qədər əsas komponenti inhibə edərək DNT sintezini gecikdirir.Taq DNT polimerazanın gecikdirilmiş əlavəsi də daxil olmaqla, əl ilə termal başlatma üsullarının əksəriyyəti xüsusilə yüksək məhsuldarlığa malik tətbiqlər üçün çətin olur.Digər termal astarlama üsulları maqnezium ionları və ya fermentlər də daxil olmaqla vacib komponenti əhatə etmək və ya şablonlar və tamponlar kimi reaktiv komponentləri fiziki olaraq təcrid etmək üçün mum qoruyucudan istifadə edir.İstilik dövrü ərzində müxtəlif komponentlər sərbəst buraxılır və mum əriyərkən bir-birinə qarışdırılır.Əl ilə isti işə salma üsulu kimi, mumdan qoruma üsulu çətin və çirklənməyə meyllidir və yüksək məhsuldarlıq tətbiqləri üçün uyğun deyil.
Platin DNT polimeraza avtomatik isti başlanğıc PCR üçün əlverişli və səmərəlidir.Platinum Taq DNT polimeraza Taq DNT polimeraza qarşı monoklonal antikorla birləşən rekombinant Taq DNT polimerazından ibarətdir.Antikorlar uzun müddət temperaturun saxlanması zamanı ferment fəaliyyətini maneə törətmək üçün PCR ilə hazırlanır.Taq DNT polimeraza denaturasiya pilləsinin 94 ℃ izolyasiyası zamanı reaksiyaya buraxıldı və tam polimeraz fəaliyyətini bərpa etdi.Termal başlanğıc üçün kimyəvi cəhətdən dəyişdirilmiş Taq DNT polimerazından fərqli olaraq, Platinum fermenti polimerazanı aktivləşdirmək üçün 94 ℃ (10-15 dəqiqə) temperaturda uzun müddətli izolyasiya tələb etmir.PlatinumTaq DNT polimerazı ilə Taq DNT polimeraz aktivliyinin 90%-i 94°C temperaturda 2 dəqiqədən sonra bərpa olundu.
11. Nest-PCR
Yuvalanmış primerlərdən istifadə edərək ardıcıl gücləndirmə dövrləri spesifikliyi və həssaslığı yaxşılaşdıra bilər.Birinci dövrə 15-20 dövrəlik standart gücləndirmədir.İlkin gücləndirmə məhsulunun kiçik bir hissəsi 100-dən 1000-ə qədər seyreltildi və 15-20 dövr üçün gücləndirmənin ikinci mərhələsinə əlavə edildi.Alternativ olaraq, ilkin gücləndirilmiş məhsul gel təmizləyərək ölçülə bilər.Gücləndirmənin ikinci turunda birinci primerin içərisindəki hədəf ardıcıllığına bağlana bilən yuvalanmış primer istifadə olunur.İç-içə PZR-in istifadəsi çoxlu hədəf sahələrin gücləndirilməsi imkanını azaldır, çünki hər iki primer dəstini tamamlayan bir neçə hədəf ardıcıllığı var.Eyni primerlərlə eyni dövrlərin ümumi sayı (30-dan 40-a qədər) qeyri-spesifik yerləri gücləndirdi.İç-içə PCR məhdud hədəf ardıcıllıqlarının (məsələn, nadir mrnas) həssaslığını artırır və çətin PCRS-in spesifikliyini yaxşılaşdırır (məsələn, 5′ RACE).
12. Azalan PCR
Azalan PCR, PCR-nin ilk bir neçə dövrü üçün sıx tavlama şərtlərindən istifadə edərək spesifikliyi artırır.Dövr təxmin edilən Tm-dən təxminən 5℃ yüksək yumşalma temperaturunda başlayır, sonra yumşalma temperaturu Tm 5℃-dən aşağı olana qədər hər dövr 1℃ ilə 2℃ azaldılır.Yalnız ən yüksək homologiyaya malik təyinat şablonu gücləndiriləcək.Bu məhsullar gücləndirilmiş qeyri-spesifik məhsulları sıxışdıraraq sonrakı dövrlərdə genişlənməyə davam edir.Azalan PCR, AFLP DNT barmaq izi kimi primer və hədəf şablonu arasında homologiya dərəcəsinin məlum olmadığı üsullar üçün faydalıdır.
Əlaqədar PCR dəstləri
2 × PCR QəhrəmanıTMMix sistemi adi PCR Mix sisteminə nisbətən PCR inhibitorlarına daha yüksək tolerantlığa malikdir və müxtəlif mürəkkəb şablonların PCR gücləndirilməsinin öhdəsindən asanlıqla gələ bilər.Unikal reaksiya sistemi və yüksək effektiv Taq Hero PCR reaksiyasını daha yüksək gücləndirmə effektivliyinə, spesifikliyinə və həssaslığına malikdir.
Daha yüksək gücləndirmə səmərəliliyi
5'→3' DNT polimeraza aktivliyinə və 5'→3' ekzonükleaza aktivliyinə malikdir, 3'→5' ekzonukleaza aktivliyi yoxdur.
Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Spesifik-optimallaşdırılmış bufer və isti başlanğıc Taq fermenti qeyri-spesifik gücləndirmə və primer dimer əmələ gəlməsinin qarşısını ala bilər.
Yüksək həssaslıq - şablonun aşağı nüsxələrini aşkar edə bilər
Dəstə unikal Foregene tərs transkripsiya reagentindən və reaksiyanın gücləndirilməsinin effektivliyini və spesifikliyini effektiv şəkildə yaxşılaşdırmaq üçün unikal reaksiya sistemi ilə birlikdə Foregene HotStar Taq DNT Polimerazından istifadə edir.
Göndərmə vaxtı: 09 may 2023-cü il
