1. İlkin anlayış

Bu mərhələdə yaşlılarımızın qarşısında səhvlərə yol verməmək üçün bəzi anlayışları və terminologiyanı başa düşməliyik, məsələn:

S: RT-PCR, qPCR, Real-time PCR və real-time RT-PCR arasında fərq nədir?

Cavab: RT-PCR tərs transkripsiya PZR-dirpolimeraza zəncirvari reaksiyanın (PZR) geniş istifadə olunan variantı olan (əks transkripsiya PCR, RT-PCR).RT-PCR-də bir RNT zəncirinin əksi tamamlayıcı DNT-yə transkripsiya edilir, daha sonra PCR ilə DNT amplifikasiyası üçün şablon kimi istifadə olunur.
Real vaxtda-PCR və qPCR(Kəmiyyət Rea-ltime-PCR) eyni şeydir, hər ikisi real vaxt rejimində kəmiyyət PCR-dir, yəni hər bir PCR dövrü real vaxt məlumat qeydlərinə malikdir, buna görə də başlanğıc şablonların sayı dəqiq analizlə tənzimlənə bilər.

Hər iki Real-time PCR (real-time floresan kəmiyyət PCR) və Reverse transkripsiya PCR (əks transkripsiya PCR) RT-PCR kimi qısaldılmış kimi görünsə də, beynəlxalq konvensiya belədir: RT-PCR xüsusi olaraq əks transkripsiyaya istinad edir.PCR , Real-time PCR ümumiyyətlə qPCR (kəmiyyət real vaxt PCR) kimi qısaldılır..

Və real vaxt rejimində RT-PCR (RT-qPCR), floresan kəmiyyət texnologiyası ilə birləşdirilmiş tərs transkripsiya PCR-dir.: əvvəlcə RNT-nin əks transkripsiyasından cDNA (RT) əldə edin və sonra kəmiyyət analizi (qPCR) üçün Real-time PCR-dən istifadə edin.Əksər laboratoriyalar RT-qPCR, yəni RNT ifadəsinin aşağı tənzimlənməsi ilə bağlı araşdırmalar aparır, buna görə də laboratoriyada hər kəsin danışdığı qPCR əslində RT-qPCR-ə aiddir, lakin klinik tətbiqlərdə hələ də çoxlu DNT testlərinin olduğunu unutmayın.Hepatit B virusu HBV aşkarlanması kimi kəmiyyət analizi.

Sual: Çoxlu floresan kəmiyyət PCR oxuduqdan sonra nə üçün gücləndirilmiş fraqment 80-300bp diapazonunda idarə olunmalıdır?

Cavab verin: Hər bir gen ardıcıllığının uzunluğu fərqlidir, bəziləri bir neçə kb, bəziləri yüzlərlə bp-dir, lakin primerlərin layihələndirilməsi zamanı məhsulun uzunluğunun yalnız 80-300bp olmasını tələb etməliyik, çox qısa və ya çox uzun olanlar flüoresan kəmiyyət PCR aşkarlanması üçün uyğun deyil.Məhsul parçası primer-dimerdən fərqləndirmək üçün çox qısadır.Primer-dimerin uzunluğu təxminən 30-40bp-dir və 80bp-dən az olduqda onun primer-dimer və ya məhsul olduğunu ayırd etmək çətindir.Məhsul parçası çox uzunsa, 300bp-dən çox olarsa, bu, asanlıqla aşağı gücləndirmə səmərəliliyinə gətirib çıxaracaq və genin miqdarını effektiv şəkildə aşkar edə bilməz.

Məsələn, bir sinifdə neçə nəfərin olduğunu sayarkən, yalnız neçə ağız olduğunu saymaq lazımdır.Eyni şey genləri aşkarladığınız zaman da doğrudur, yalnız bir genin müəyyən bir ardıcıllığını təmsil etmək üçün bütün ardıcıllığı tapmalısınız.İnsanları saymaq istəyirsənsə, həm ağzını, həm burnunu, həm qulaqlarını, həm də eynəklərini saymalısan və səhv etmək asandır.

Genişləndirmək üçün, bioloji tədqiqatlarda nöqtədən əraziyə bir çox tədqiqat halları var, çünki hər hansı bir növün gen ardıcıllığı çox uzundur, bütün fraqmentləri ölçmək lazımsızdır və mümkün deyil, məsələn, bakterial 16S ardıcıllığı, yəni bakteriyaların mühafizəkar ardıcıllığını həyata keçirmək, müəyyən bir bakteriya populyasiyasının sayını çıxarmaq üçün Assays.

S: qPCR primer dizaynı üçün optimal uzunluq nədir?

Cavab verin: Ümumiyyətlə, primer uzunluğu təxminən 20-24bp-dir, bu daha yaxşıdır.Əlbəttə ki, astarın layihələndirilməsi zamanı primerin TM dəyərinə diqqət yetirməliyik, çünki bu, optimal yumşalma temperaturu ilə bağlıdır.Çoxlu təcrübələrdən sonra 60°C-nin daha yaxşı TM dəyəri olduğu sübut edilmişdir.Yuyulma temperaturu çox aşağı olarsa, bu, asanlıqla qeyri-spesifik gücləndirməyə səbəb olacaqdır.Əgər yumşalma temperaturu çox yüksək olarsa, gücləndirmə səmərəliliyi nisbətən aşağı olacaq, gücləndirmə əyrisinin pik nöqtəsi daha sonra başlayacaq və CT dəyəri gecikəcək.

S: Boya üsulu zond üsulundan nə ilə fərqlənir?

Cavab: Boya üsuluBəzi flüoresan boyalar, məsələn, SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO və s., öz-özünə işıq yaymır, lakin ikiqat zəncirli DNT-nin kiçik yivinə bağlandıqdan sonra flüoresan saçacaq.Buna görə də, PCR reaksiyasının başlanğıcında maşın flüoresan siqnalı aşkar edə bilmir.Reaksiya tavlama-uzatma mərhələsinə çatdıqda qoşa zəncir açılır və DNT polimerazanın təsiri altında yeni zəncir sintez olunur və flüoresan molekul dsDNA kiçik yivinə bağlanır.PCR dövrlərinin sayı artdıqca, getdikcə daha çox boyalar cüt zəncirli DNT ilə birləşdirilir və flüoresan siqnal da davamlı olaraq gücləndirilir.Boya üsulundan əsasən elmi tədqiqatlarda istifadə olunur.
P.S: Təcrübə edərkən diqqətli olun, boya insan DNT-si ilə birləşməlidir, onu floresan insana çevirməyə diqqət edin.

Boya üsulu (solda) Prob üsulu (sağda)
P.S: Təcrübə edərkən diqqətli olun, boya insan DNT-si ilə birləşməlidir, onu floresan insana çevirməyə diqqət edin.

SYBR Green Ⅰ DNT-nin kiçik yivinə bağlanır

Prob üsuluTaqman zondu ən çox istifadə edilən hidroliz zondudur.Zondun 5′ ucunda flüoresan qrupu var, adətən FAM və zond özü də hədəf geni tamamlayan ardıcıllıqdır.3′ ucunda flüoresan söndürmə qrupu var.Flüoresan rezonans enerjisinin ötürülməsi prinsipinə əsasən (Förster rezonans enerjisinin ötürülməsi, FRET), məruzəçi flüoresan qrupu (donor flüoresan molekulu) və söndürən flüoresan qrupu (qəbuledici flüoresan molekul) həyəcanlandıqda Spektrlər üst-üstə düşdükdə və məsafə çox yaxın olduqda (7-10 nm flüoresans), qəbuledici molekul, avtoflüoressensiya isə zəifləyir.Buna görə də, PCR reaksiyasının başlanğıcında, zond sistemdə sərbəst və bütöv olduqda, reportyor flüoresan qrupu flüoresans yaymayacaq.Yuvlama zamanı primer və zond şablona bağlanır.Uzatma mərhələsində polimeraza davamlı olaraq yeni zəncirləri sintez edir.DNT polimeraza 5′-3′ eksonükleaz aktivliyinə malikdir.Proba çatdıqda, DNT polimeraza probu şablondan hidroliz edəcək, məruzəçi flüoresan qrupunu söndürən flüoresan qrupundan ayıracaq və flüoresan siqnalı buraxacaq.Zond ilə şablon arasında tək-tək əlaqə olduğu üçün sınağın dəqiqliyi və həssaslığı baxımından zond üsulu boyama üsulundan üstündür.Diaqnozda əsasən prob üsulundan istifadə olunur.

S: Mütləq kəmiyyət nədir?Nisbi Kəmiyyət nədir?

Cavab verin: Mütləq kəmiyyət qPCR ilə yoxlanılacaq nümunənin ilkin nüsxə nömrəsinin hesablanmasına aiddir, məsələn, 1 ml qanda neçə HBV virusu var.Nisbi kəmiyyətlə əldə edilən nəticə, konkret nümunədəki hədəf genin miqdarının başqa bir istinad nümunəsinə nisbətən dəyişməsidir və gen ifadəsi yuxarı və ya aşağı tənzimlənir.

S: RNT ekstraksiyasının miqdarı, əks transkripsiyanın effektivliyi və gücləndirmə effektivliyi eksperimental nəticələrə təsir edəcəkmi?
S: Nümunənin saxlanması, ekstraksiya reagentləri, əks transkripsiya reagentləri və işıq ötürən materiallar eksperimental nəticələrə təsir edəcəkmi?
S: Hansı üsul eksperimental məlumatları düzəldə bilər?

Bu məsələlərlə əlaqədar olaraq, biz onları aşağıdakı qabaqcıl və qabaqcıl bölmələrdə ətraflı təsvir edəcəyik.
2. Qabaqcıl bilik

Real vaxt rejimində flüoresan kəmiyyət PCR-ə gəldikdə, hər il minlərlə elmi tədqiqat məqaləsinin nəşr olunduğu reallığı qəbul etməliyik, bunların arasında flüoresan kəmiyyət PCR texnologiyası az deyil.

Floresan kəmiyyət PCR təcrübəsini ölçmək üçün ümumi standart yoxdursa, nəticələr çox fərqli ola bilər.Eyni növün eyni geni üçün, eyni emal üsulu ilə, aşkarlama nəticələri də geniş şəkildə dəyişəcək və gec gələnlər üçün eyni nəticələri təkrarlamaq çətin olacaq.Siz hansının doğru, hansının yanlış olduğunu heç kim bilmir.

Bu, flüoresan kəmiyyət PCR-nin saxta texnologiya və ya etibarsız texnologiya olduğunu bildirirmi?Xeyr, çünki flüoresan kəmiyyət PCR daha həssas və daha dəqiqdir və bir az səhv əməliyyat tamamilə əks nəticələr verəcəkdir.Kiçik bir itki min mil məsafədədir.Məqalə müəllifi resenziyaçılar tərəfindən dəfələrlə işgəncəyə məruz qala bilər.Eyni zamanda, jurnalın rəyçilərini müxtəlif eksperimental nəticələrdən seçmək də çətindir.

Ümumiyyətlə, real vaxt PCR təcrübələrində konsensusun olmamasına işarə edir.Bu məqsədlə sənayenin böyük alimləri standartları formalaşdırmağa başladılar,ianəçilərdən bu standartlara cavab vermək üçün məqalədə bəzi zəruri eksperimental və məlumatların işlənməsi təfərrüatlarını (zəruri məlumatlar daxil olmaqla) təqdim etmələrini tələb edir.

Rəyçilər bu detalları oxuyaraq eksperimentin keyfiyyətini mühakimə edə bilərlər;gələcək oxucular da bundan təcrübəni təkrarlamaq və ya təcrübəni təkmilləşdirmək üçün istifadə edə bilərlər.Onda bu şəkildə əldə edilən eksperimental nəticələr məlumatla dolu, yüksək keyfiyyətli və istifadəyə yararlı olur.

MIBBI (Bioloji və Biotibbi Tədqiqatlar üçün Minimum Məlumat -http://www.mibbi.org) meydana gəldi.MIBBI təcrübələr üçün standartlar təmin edən bir layihədir.Təbiətdə nəşr olunur.Bu layihə müxtəlif bioloji təcrübələrə, o cümlədən hüceyrə biologiyası, Mikroarray, indi müzakirə edəcəyimiz qPCR və s. hədəflənib və əlyazmaları təqdim edərkən hər bir eksperiment növünü nəzərdə tutur.Bu məlumat hər zaman verilməlidir.

MIBBI layihəsində flüoresan kəmiyyət PCR ilə bağlı iki məqalə var, yəni:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) – real vaxtda kəmiyyət PCR məlumatları üçün strukturlaşdırılmış dil və hesabat bələdçisi;
·MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) – real vaxt rejimində kəmiyyət PCR təcrübələri haqqında məqalələr dərc etmək üçün minimum məlumat.
Əvvəlcə RDML, terminologiyanın spesifikasiyası haqqında danışaq.

Hər şeyin standart tərifi yoxdursa, müzakirəni davam etdirmək mümkün deyil, buna görə də imtahanda terminlərin izahı çox vacibdir.
Floresan kəmiyyət PCR təcrübəsində istifadə olunan terminologiya aşağıdakı məzmunu ehtiva edir.QIAGEN bizim üçün ən yaxşı xülasəni hazırladı.Aşağıdakıların hamısı qurudurmallar .

Gücləndirmə əyrisi
Gücləndirmə əyrisi PZR prosesi zamanı yaradılmış əyriyə aiddir, dövr nömrəsi absis kimi və real vaxtda flüoresan intensivliyi reaksiya zamanı ordinat kimidir.

Mükəmməl gücləndirmə əyrisi aşağıdakı xüsusiyyətlərə malik olmalıdır: baza düzdür və ya bir qədər azalıb və açıq-aydın yüksəliş tendensiyası yoxdur;əyrinin əyilmə nöqtəsi aydındır və eksponensial fazanın mailliyi gücləndirmə səmərəliliyinə mütənasibdir.Yamac nə qədər böyükdürsə, gücləndirmə səmərəliliyi bir o qədər yüksəkdir;ümumi gücləndirmə əyrisi Paralellik yaxşıdır, hər bir borunun gücləndirmə səmərəliliyinin oxşar olduğunu göstərir;aşağı konsentrasiyalı nümunələrin gücləndirmə əyrisinin eksponensial mərhələsi göz qabağındadır.

Baza (Əsas)
Baza ilkin dövrün səs-küy səviyyəsidir, adətən 3-cü və 15-ci dövrlər arasında ölçülür, çünki gücləndirmə məhsulunun yaratdığı flüoresan dəyər artımı bu müddət ərzində aşkar edilə bilməz.Baza xəttini hesablamaq üçün istifadə edilən dövrlərin sayı müxtəlif ola bilər və yüksək şablon məbləğləri istifadə edildikdə və ya hədəf genin ifadə səviyyəsi yüksək olarsa, azaldılması tələb oluna bilər.

Əsas xəttin qurulması xətti gücləndirmə əyrisindən flüoresan məlumatlarına baxmağı tələb edir.Baza xətti elə qurulub ki, gücləndirmə əyrisinin artımı başlanğıc dövrünün yuxarı sayından çox olan dövr sayı ilə başlasın.Əsas xətlər hər bir hədəf ardıcıllığı üçün ayrıca təyin edilməlidir.Erkən dövrlərdə aşkar edilmiş orta flüoresan dəyərləri gücləndirilmiş məhsullarda əldə edilən flüoresans dəyərlərindən çıxılmalıdır.Müxtəlif Real-Time PCR proqram təminatının ən son versiyaları fərdi nümunələr üçün əsas parametrlərin avtomatik optimallaşdırılmasına imkan verir.

PCR gücləndirmə reaksiyasının ilk bir neçə dövrü ərzində flüoresan siqnalı çox dəyişmir.Düz xəttə yaxınlaşmaq əsas xətt adlanır, lakin ilk bir neçə dövrə yaxından baxsaq, aşağıdakı şəkildə baş verənlərin əsas xətt daxilində olduğunu görərik.

Background Background istinad edir
reaksiyada qeyri-spesifik flüoresan dəyəri.Məsələn: səmərəsiz flüoresan söndürmə;və ya SYBR Green istifadəsinə görə çoxlu sayda ikiqat zəncirli DNT şablonları.Siqnalın fon komponentləri Real-Time PCR proqram alqoritmi ilə riyazi olaraq silinir.

Müxbir siqnalı
Məruzəçi siqnalı Real-Time PCR zamanı SYBR Green və ya flüoresan etiketli ardıcıllıqla xüsusi zondlar tərəfindən yaradılan flüoresan siqnala aiddir.

Normallaşdırılmış reportyor siqnalı (RN)
RN məruzəçi boyanın flüoresans intensivliyinin hər dövrədə ölçülən passiv istinad boyasının flüoresans intensivliyinə bölünməsi deməkdir.

Passiv istinad boyası
Bəzi Real-Time PCR-lərdə,floresan boyası ROX flüoresan siqnalını normallaşdırmaq üçün daxili istinad kimi istifadə olunur.Qeyri-dəqiq pipetləmə, quyu mövqeyi və flüoresan dalğalanmaları ilə əlaqədar dəyişiklikləri quyudan-quyu əsasında düzəldir.

Floresans həddi (ərəfəsində)
fon dəyərindən yuxarı və gücləndirmə əyrisinin plato dəyərindən əhəmiyyətli dərəcədə aşağı düzəldilmişdir.O, PCR aşkarlamasının log-xətti diapazonunu təmsil edən gücləndirmə əyrisinin xətti bölgəsində yerləşməlidir.PZR-nin log-xətti fazasının asanlıqla müəyyən edilməsi üçün həddlər log-amplifikasiya əyrisi görünüşündə təyin edilməlidir.Real-Time PCR-də bir neçə hədəf gen varsa, hədd hər bir hədəf üçün təyin edilməlidir.Ümumiyyətlə, PZR reaksiyasının ilk 15 dövrünün flüoresan siqnalı flüoresan fon siqnalı kimi istifadə olunur və flüoresans həddi PZR-nin ilk 3-15 dövrünün flüoresan siqnalının standart sapmasından 10 dəfə çoxdur və flüoresan həddi PCR amonplification fazasında müəyyən edilir.Ümumiyyətlə, hər bir alətin istifadə etməzdən əvvəl müəyyən edilmiş flüoresan həddi var.

Dövr həddi (CT) və ya kəsişmə nöqtəsi (CP)
Gücləndirmə əyrisinin eşik həddini keçdiyi dövr (yəni, flüoresansın aşkarlanmasının əhəmiyyətli dərəcədə artdığı nöqtə).CT bir hissə ola bilər və başlanğıc şablonunun miqdarı hesablana bilər.CT dəyəri hər bir PCR reaksiya borusunda flüoresan siqnal müəyyən edilmiş həddə çatdıqda yaşanan dövrlərin sayını əks etdirir.Hər bir şablonun CT dəyəri ilə şablonun ilkin surət nömrəsinin loqarifmi arasında xətti əlaqə var,ilkin nüsxənin sayı nə qədər yüksəkdirsə, CT dəyəri bir o qədər kiçikdir və əksinə.İlkin nüsxə nömrəsi məlum olan standartdan istifadə etməklə standart əyri hazırlana bilər, burada absis CT dəyərini, ordinat isə ilkin surət nömrəsinin loqarifmini təmsil edir.Buna görə də, naməlum nümunənin KT dəyəri alındıqca, nümunənin ilkin nüsxə nömrəsi standart əyridən hesablana bilər.

ΔCT dəyəri
ΔCT dəyəri təsvir edirhədəf gen və müvafiq endogen istinad gen CT dəyəri arasındakı fərq, məsələn, ev təsərrüfatı geni və istifadə olunan şablonun miqdarını normallaşdırmaq üçün istifadə olunur:
⇒ΔCT = CT (hədəf gen) – CT (endogen istinad gen)

ΔΔCT dəyəri
ΔΔCT dəyəri maraq nümunəsinin (məsələn, stimullaşdırılmış hüceyrələr) orta ΔΔCT dəyəri ilə istinad nümunəsinin (məsələn, stimullaşdırılmamış hüceyrələr) orta ΔΔCT dəyəri arasındakı fərqi təsvir edir.İstinad nümunəsi həmçinin kalibrləmə nümunəsi adlanır və bütün digər nümunələr nisbi kəmiyyət üçün normallaşdırılır:
⇒ΔΔCT = orta ΔCT (maraq nümunəsi) – orta ΔCT (istinad nümunəsi)

Endogen istinad genləri (endogen istinad genləri)
Ev təsərrüfatı genləri (təsərrüfat genləri) kimi endogen istinad genlərinin ifadə səviyyələri nümunələr arasında fərqlənmir.Referans genin KT qiymətlərinin hədəf genlə müqayisəsi hədəf genin ifadə səviyyəsini daxil olan RNT və ya cDNA miqdarına normallaşdırmağa imkan verir (yuxarıda ΔCT dəyərləri bölməsinə baxın).

Daxili istinad genləri üçün uyğundurmümkün RNT deqradasiyası və ya RNT nümunələrində ferment inhibitorlarının olması, həmçinin RNT tərkibindəki dəyişikliklər, əks transkripsiyanın effektivliyi, nuklein turşusunun bərpası və nümunə ilə işləmə.Optimal istinad gen(lər)ini seçmək üçün biz alqoritmi dəyişdirdik ki, onun eksperimental parametrdən asılı olaraq optimal istinadı seçməsinə imkan yaratdıq.

Daxili nəzarət
Hədəf ardıcıllığı ilə eyni reaksiyada gücləndirilən və fərqli bir zondla yoxlanan nəzarət ardıcıllığı (yəni, dupleks PCR yerinə yetirilməsi).Daxili nəzarət çox vaxt uğursuz gücləndirmələri istisna etmək üçün istifadə olunur, məsələn, hədəf ardıcıllığı aşkar edilmədikdə.
Kalibrləmə nümunəsi
Bir genin nisbi ifadə səviyyəsini müəyyən etmək üçün bütün digər nümunələri müqayisə etmək üçün nisbi kəmiyyət təyinində istifadə edilən istinad nümunəsi (məsələn, hüceyrə xətti və ya toxumasından təmizlənmiş RNT).Kalibrləmə nümunəsi istənilən nümunə ola bilər, lakin adətən nəzarətdir (məsələn, təmizlənməmiş nümunə və ya təcrübənin sıfır vaxtından nümunə).

Müsbət nəzarət
ilə nəzarət reaksiyalarından istifadə edinşablon miqdarı məlumdur.Astar dəstinin və ya primer-zond dəstinin düzgün işləməsini və reaksiyanın düzgün qurulduğunu yoxlamaq üçün çox vaxt müsbət nəzarətlərdən istifadə olunur.

Şablon nəzarəti yoxdur (NTC)
Adətən su ilə əvəz olunan şablon istisna olmaqla, gücləndirmə reaksiyasının bütün zəruri komponentlərini ehtiva edən nəzarət reaksiyası.NTC-nin istifadəsi reagentlərin çirklənməsinin və ya xarici DNT-nin səbəb olduğu çirklənməni tapa bilər, beləliklə, aşkarlama məlumatlarının həqiqiliyini və etibarlılığını təmin edir.NTC nəzarətinin gücləndirilməsi çirklənməni göstərir.

RT nəzarəti yoxdur (NRT)
RNT çıxarılması prosesi son dərəcə zərərli olan qalıq genomik DNT-ni ehtiva edə bilər və məlumatların keyfiyyətinə təsir edən günahkar və qPCR-nin təbii düşmənidir, buna görə də eksperimentlər tərtib edərkən o, yalnız RNT aşkarlanmasını gücləndirmək üçün hazırlanmalıdır.İki yol var, biri intronlar arasında primerlərin layihələndirilməsi, digəri isə DNT-nin tamamilə çıxarılmasıdır, hansının daha yaxşı olduğunu, daha sonra müzakirə edəcəyik.NTR nəzarəti DNT çirklənməsini aşkar etmək üçün sehrli güzgüdür.Əgər gücləndirmə varsa, deməli, çirklənmə var.

Standartlar
Standartlar, standart əyri qurmaq üçün istifadə edilən məlum konsentrasiya və ya surət nömrəsi nümunələridir.Standartın sabitliyini təmin etmək üçün adətən gen fraqmenti plazmidə klonlanır və standart kimi istifadə olunur.

Standart əyri
adətən ikiqat nisbətinə uyğun olaraq standart məhsulla ən azı 5 konsentrasiya qradiyenti ilə seyreltilir və CT dəyərinin və surət nömrəsinin koordinatlarında 5 nöqtə çəkilir və standart əyri yaratmaq üçün nöqtələr bir xətt yaratmaq üçün birləşdirilir.Hər bir standart əyri üçün onun etibarlılığı yoxlanılmalıdır.Yamacın dəyəri –3,3 ilə –3,8 arasında olur və hər bir konsentrasiya üç dəfə yerinə yetirilir.Digər nöqtələrdən əhəmiyyətli dərəcədə fərqli olan nöqtələr atılmalıdır.Sınaq ediləcək nümunənin CT dəyəri standart əyriyə gətirilir və sınaqdan keçiriləcək nümunənin ifadə səviyyəsi hesablana bilər.

Sınaq ediləcək nümunənin KT dəyəri standart əyriyə gətirilir və sınaqdan keçiriləcək nümunənin ilkin nüsxə nömrəsi hesablana bilər.

Səmərəlilik və Yamac
Standart əyrinin mailliyi real vaxtda PCR-nin səmərəliliyini əks etdirir.
· -3,322 yamac PZR gücləndirmə effektivliyinin 1 və ya 100% səmərəli olduğunu və hər dövrədə PCR məhsulunun miqdarının iki dəfə artdığını göstərir.
· –3,322-dən (məsələn, –3,8) aşağı olan yamac PCR effektivliyini göstərir
· –3.322-dən (məsələn, –3.0) böyük yamac PZR effektivliyinin 100%-dən çox olduğunu göstərir, bu maraqlıdır, PCR-nin bir dövrü gücləndirilmiş məhsulu iki dəfədən çox necə yarada bilər?Bu vəziyyət PCR reaksiyasının qeyri-xətti mərhələsində baş verir, yəni çox miqdarda qeyri-spesifik gücləndirmə var.

ərimə əyrisi
qPCR gücləndirilməsi tamamlandıqdan sonra PCR məhsulu qızdırılır.Temperatur yüksəldikcə, ikiqat amplifikasiya məhsulu tədricən əriyir və flüoresans intensivliyinin azalması ilə nəticələnir.Müəyyən bir temperatura (Tm) çatdıqda, çox sayda məhsul əriyəcəkdir.Floresans kəskin şəkildə azalır.Fərqli PCR məhsulları fərqli Tm dəyərlərinə və fərqli ərimə temperaturlarına malikdir, beləliklə, PCR-nin spesifikliyini müəyyən etmək olar.

Ərimə əyrisi (törəmə əyri)
Ərimə əyrisi PCR məhsul fraqmentlərinin vəziyyətini daha intuitiv şəkildə göstərə bilən pik xəritəsini yaratmaq üçün əldə edilir.Ərimə temperaturu DNT fraqmentinin Tm dəyəri olduğundan, fraqment ölçüsü, GC məzmunu və s. kimi DNT fraqmentinin Tm dəyərinə təsir edən bəzi parametrlər mühakimə edilə bilər. Ümumiyyətlə, bizim primer dizayn prinsiplərimizə uyğun olaraq,gücləndirilmiş məhsulun uzunluğu 80-300bp aralığındadır, buna görə də ərimə temperaturu 80 ° C ilə 90 ° C arasında olmalıdır.

Ərimə əyrisinin şərhi: Əgər yeganə əsas zirvə 80°C-90°C arasında görünürsə, bu o deməkdir ki, flüoresan kəmiyyət PCR mükəmməldir;əsas zirvə 80 ° C-90 ° C arasında görünürsə və müxtəlif zirvələr 80 ° C-dən aşağı görünürsə, primer dimer əsasən nəzərə alınır.Onu həll etmək üçün tavlama temperaturunu artırmağa cəhd edə bilərsiniz;əsas zirvə 80°C-90°C arasında görünürsə və müxtəlif pik temperatur yüksəldikdə yenidən yaranırsa, əsasən DNT çirklənməsinin olduğu hesab edilir və təcrübənin ilkin mərhələsində DNT-nin çıxarılması lazımdır.

Təbii ki, hələ də bəzi anormal vəziyyətlər var ki, bunlar bir-bir aşağıda bölünəcək.
3. Qabaqcıl bilik

qPCR etmək üçün MIQE deməliyəm,Minimum Məlumatnəşri üçünKəmiyyətReal vaxtda PCRTəcrübələr - real vaxtda kəmiyyət PCR haqqında məqalələr dərc etmək üçün minimum məlumattəcrübələr.Hər kəsin anlayışını asanlaşdırmaq üçün biz əsas məzmunu sadələşdirəcəyik.

İnternetdə MIQE-nin orijinal mətnini axtara bilərsiniz və ən əsası odur ki, oradaməqalə dərc edilərkən təqdim edilməli olan məlumat yoxlama siyahısı .

Rəyçilər bu detalları oxuyaraq eksperimentin keyfiyyətini mühakimə edə bilərlər;gələcək oxucular da bundan təcrübəni təkrarlamaq və ya təkmilləşdirmək üçün istifadə edə bilərlər.
Qeyd etmək lazımdır ki, bu siyahıda hər bir siyahının əhəmiyyəti müvafiq olaraq E və ya D ilə qeyd olunur.Bunun mənası nədi?E: əsas məlumat (təqdim edilməlidir);D: arzu olunan məlumat (mümkün qədər təmin edin).

MIQE (1) — Eksperimental Dizayn
Magistratura təhsilini başa vurduqdan sonra müdafiəsini başa vuran bir çox əclaf müstəqil olaraq eksperiment tərtib etməyi, dəftərlərini açmağı və müəllimin dediklərini yerinə yetirməyi bilməyəcək.Nəticədə eksperimental dizayn ciddi olmayıb və jurnalın redaksiya şöbəsi bu şəkli və o şəkli düzəltmək istədiklərini, buna görə də çaşqınlıqla bunu etdiklərini bildiriblər.Əclaflar belə hazırlanır!

Evə daha yaxın olan təcrübənin ilk prinsipi müəyyən etməkdireksperimental məntiqin sərtliyi.Ən fundamental şey eksperimental dizayndır və eksperimental dizaynda ən vacib şey hədəf nümunənin, istinad nümunəsinin (nəzarət) və təkrarların sayını necə təyin etməkdir ki, eksperimental məlumatlara istinad edilə, müqayisə oluna və inandırıcı ola bilsin.

Hədəf nümunəsimüəyyən bir müalicədən sonra hədəf geni aşkar etməyimizi tələb edən nümunəyə aiddir.İstinad nümunəsiheç bir müalicəsi olmayan nümunədir, buna biologiyada çox vaxt vəhşi tip deyilir.

Eksperimental təkrarlarçox vacibdir.Ümumiyyətlə, inandırıcı təkrarların sayı üçdən çox olmalıdır.Bioloji replikasiyanın nə olduğunu və texniki təkrarlamanın nə olduğunu ayırd etmək lazımdır.

Bioloji Replikatlar: Fərqli materiallarla eyni yoxlama təcrübəsi (zaman, bitkilər, partiyalar, reaksiya lövhələri).

Bioloji dublikasiya
Nümunə olaraq bibərin pestisidlərlə müalicəsini götürək.Biz ABC-nin üç bitkisinə pestisidlər səpmək istəyirik, sonra ABC-nin üç bitkisi üç bioloji təkrardır və onlar müxtəlif materiallarla aparılan eyni yoxlama təcrübəsidir.Amma təcrübə olaraq mütləq nəzarət lazımdır, ona görə də biz A bitkisinin budaqlarından birini çiləyərək A bitkisinin eksperimental qrupunu əmələ gətirə bilərik, A bitkisinin digər budaqlarına isə nəzarət qrupunu səpməyək.B və C üçün də eyni şeyi edin.

Texniki Replikatlar (Texniki Təkrarlar): Bu, əslində eyni materiala daxil olan dublikat dəlik olan əməliyyat nəticəsində yaranan səhvlərin qarşısını almaq üçün nəzərdə tutulmuş təkrar sınaqdır.Həm müalicə, həm də nəzarətdə hədəf genin və daxili istinad geninin təkrar parametrləri (minimum üç) olmalıdır.

Texniki təkrar
Yenə misal olaraq pestisidlərlə müalicə olunan bibəri götürün.A bitkisinin eksperimental qrupu üçün, aşkar edildikdən sonra orta nəticəni götürmək üçün onun hədəf geni və daxili istinad geni üçün müvafiq olaraq 1, 2 və 3-dən ibarət üç PCR dəliyi açdıq.Bitki A Qruplarına nəzarət üçün də eyni şəkildə müalicə olunur.Eyni şəkildə, B və C bitkiləri üçün eyni müalicəni edin.Bu texniki təkrardır.

Bunu qeyd etmək yerinə düşərStatistikaya daxil olan bioloji təkrardır, texniki təkrar isə eksperimental prosesdə təsadüfi hadisələrin olub-olmadığını yoxlamaqdan ibarətdir ki, beləliklə, eksperimental nəticələr etibarlı olsun, yəni tez-tez dediyimiz kimi onların ortalamasını götürərək səhvlərdən qaçınsın.

Mənfi Nəzarət - NTC və NRT
NTC (Şablonsuz Nəzarət), şablonu olmayan nəzarət eksperimental materialın çirklənmiş olub olmadığını yoxlamaq üçün istifadə olunur.Ümumiyyətlə, su şablon kimi istifadə olunur.Floresan reaksiyası varsa, bu, laboratoriyada nuklein turşusu ilə çirklənmənin baş verdiyini göstərir.

Bu çirklənmələr aşağıdakılardan qaynaqlanır: natəmiz su, tərkibində endogen DNT olan qeyri-ixtisaslaşdırılmış reagentlər, primer çirklənməsi, laboratoriya avadanlığının çirklənməsi, aerozol çirklənməsi və s., RNaz təmizləyiciləri və RNaz inhibitorlarından istifadə etmək lazımdır.Aerozol çirklənməsini tapmaq ən çətindir.Təsəvvür edin ki, laboratoriyanız havada müxtəlif nuklein turşuları olan duman kimidir.

NRT (Tərs transkriptaza yoxdur), əks transkripsiyası olmayan nəzarət, mənfi nəzarət kimi əks transkripsiya edilməmiş RNT-dir ki, bu da gDNT qalıqlarına nəzarətdir.

Gen ifadəsini yerinə yetirərkən, əks transkripsiyadan sonra cDNA miqdarı aşkar edilərək RNT miqdarı aşkar edilir.RNT təmizləndikdə gDNT qalığı varsa, bu, eksperimental nəticələrdə səhvlərə səbəb olacaq, çünki əldə edilən faktiki nəticələr gDNA və cDNA-dır.Yalnız cDNA deyil, məcmu səviyyədə, RNT hasilatı zamanı gDNA-nın tamamilə çıxarılması lazımdır.

MIQE (2)—nümunə məlumat
Sözdə nümunə məlumat o deməkdir ki, biz qPCR haqqında məqalə dərc edərkən məqalənin əvəzedilməz hissəsi olan nümunə məlumatını aydın şəkildə izah etməliyik.Eynilə, biz nümunələri emal edərkən, nümunələrin etibarlılığını təmin etmək üçün öz əməliyyatlarımızı da tənzimləməliyik.

Nümunənin təsviri yalnız bir nəticədir və biz bütün təcrübə zamanı götürülmüş materiallara daha çox diqqət yetirməliyik.

Eksperimental materialların seçilməsi
Qan nümunələri - təzə qan seçin, 4 saatdan çox olmayaraq.Hüceyrə nümunələri - güclü böyümə dövründə təzə hüceyrələri toplamaq üçün seçin.Heyvan toxuması - təzə, güclü böyüyən toxuma seçin.Bitki toxuması - təzə, gənc toxuma seçin.

Bu bir neçə cümlədə əsas söz olduğunu görmüsünüz: təzə.
Yuxarıdakı nümunələr üçün bazarda ən yaxşı, sərfəli və sabit dəst DNT və RNT-ni tez və asanlıqla çıxara bilən Foregene dəstidir.

Qan DNT Mini Kit

Hüceyrə Toplam RNT İzolyasiya Kiti

Heyvanların Ümumi RNT İzolyasiya Kiti

Bitki Ümumi RNT İzolyasiya Kiti

Bitki Total RNT İzolyasiya Kiti Plus

Bitki DNT İzolyasiya Kiti

Eksperimental materialların saxlanması
Ümumiyyətlə, şərtlər icazə verərsə, nümunələri saxlamağı məsləhət görmürük.Bununla belə, nümunə götürdükdən dərhal sonra təcrübə apara bilməyən çoxlu dostlar var və bəziləri hətta nümunə götürmək üçün sahəyə maye azot çənləri daşımalı olurlar.

Bu cür zəhmətkeş dost üçün yalnız deyə bilərəm ki, siz reagent sərfiyyatını başa düşmürsünüz.İndi bir çox reagent istehlakı şirkətləri RNT nümunələrini otaq temperaturunda saxlaya bilən reagentlər istehsal edir və siz onlardan istifadə etməyi seçə bilərsiniz.Ənənəvi saxlama üsulu, daşınması asan olan kiçik bir maye azot çəni istifadə edərək, maye azot anbarıdır.Nümunəni yenidən laboratoriyaya gətirdikdən sonra onu -80°C soyuducuda saxlayın.

RNT-ni əhatə edən təcrübələr üçün altı sözdən ibarət prinsipə əməl edilməlidir:aşağı temperatur, fermentlər yoxdur,vəsürətli .

Aşağı temperatur anlayışını başa düşmək asandır;fermentlər olmadan, RNase yaşadığımız dünyanın hər yerində var (əks halda siz HİV tərəfindən öldürülərdiniz), buna görə də təcrübələr apararkən RNase-dən necə qaçınmaq çox vacib bir anlayışdır;sürətli,Dünyada elə bir kunq-fu yoxdur ki, onu sındırmaq olmaz, yalnız sürəti pozmaq olmaz.

Buna görə də, müəyyən mənada, çıxarma müddəti nə qədər qısa olsa, dəst bir o qədər yaxşıdır.NiyəForegene's dəsti sürəti vurğulayır, çünki onlar bunu yaxşı bilirlər.

P.S: Bəzi qızlar eksperimentləri çox diqqətlə edirlər, lakin bir neçə illik işdən sonra slam dunk qədər yaxşı deyillər.Onlar Allahın ədalətsiz olduğunu düşünür, başqalarından şikayətlənir və həyat axtarırlar.Əslində o bunu başa düşmürdü.O, RNT-ni yaxşı qoruya bilmədi və slam-dunk oyunçusu çevik idi.Təcrübəni edərkən o, üç dəfə, beş dəfə və iki bölünmə ilə slem-dunk başa vuracağını düşünürdü, lakin təcrübəni yaxşı etdi.

Qeyd: Daha yavaş, daha çox RNase işğalı şansı.Özünüzü sürətli olmağa necə öyrətmək olar?Heç bir yol yoxdur, sadəcə daha çox məşq edin.

Müxtəlif təcrübələr və müxtəlif nümunələr üçün hələ də daha çox ədəbiyyat oxumaq və emal üçün uyğun bir üsul seçmək lazımdır.Nümunələrin toplanması və saxlanması prosesi üçün MIQE onun kağızda aydın şəkildə yazılmasını tələb edir ki, rəyçilər kağızın etibarlılığını nəzərdən keçirə bilsinlər və heyrətə gələn gənclərin təcrübənizi təkrarlaması da rahatdır.

Bioloji təcrübələr çətin olsa da, yüksək səviyyəlidir.Ehtiyatlı olmasan, dünyanı alt-üst edə bilərsən.Məsələn, SARS-ı biokimyəvi böhrana çevirmək və ya 1,3 milyard insanı xilas etmək üçün hibrid düyü hazırlamaq.Aşağıdakı şəkil kimyəvi bir təcrübədir, onun sikə bənzər görünüşünə baxaraq araşdırmanızdan nə qədər qürur duyduğunuzu başa düşməlisiniz.Unutma, onu qaralama.

MIQE (3) – nuklein turşusunun çıxarılması.
Nuklein turşusunun çıxarılması böyük hadisədir və bütün molekulyar biologiya təcrübələri nuklein turşusunun çıxarılması ilə başlayır.Əvvəlcə MIQE-nin nuklein turşusu ekstraksiyasına dair məzmununu kopyalayaq.

Bu formaya baxanda səthdə qala bilməzsən.Forma bir dogmadır.Ən yaxşı tələbə olmaq üçün bunun səbəbini soruşmalısınız.Bu cədvəlin əsas məzmunu budur: Təqib edinRNT-nin saflığı, bütövlüyü, tutarlılığı və ekstraksiya miqdarı .

Birinci hissəsiproses və ya alət nuklein turşusunun çıxarılması mərhələsidir.Əgər siz çıxarmaq üçün avtomatik nuklein turşusu ekstraktorundan istifadə edirsinizsə (qabaqcıl, satın almaq üçün mənimlə əlaqə saxlayın), alətin model adını göstərməlisiniz.

Kitin adı və

Dəyişiklik təfərrüatları üçün hansı dəstdən istifadə edildiyi, hansı xüsusi reagentlərin əlavə edildiyi və ya hansı xüsusi əməliyyatların edildiyi aydın şəkildə izah edilməlidir ki, başqaları sizin təcrübənizi asanlıqla təkrarlaya bilsin.

Bəzi insanlar xüsusi nümunələr çıxararkən bunun onların gizli silahı olduğunu düşünərək bəzi xüsusi reagentlər əlavə edirlər və başqalarına demirlər.Gizli saxlamaqla yanaşı, məqalənizi parlaq etmək imkanını da itirirlər.Ağıllı olma, elmi araşdırmada ölkə qoca Zhangdan daha dürüst olmalısan, əgər ağıllı olmaq istəyirsənsə, məqalə səni axmaq edəcək.

dəstin məhsul nömrəsini yadda saxlamalıdırdəsti sifariş etdikdə və məqaləni yazdıqda.Dəstdə ümumiyyətlə iki nömrə var: Cat—kataloq nömrəsi (məhsul nömrəsi, məqalə nömrəsi), Lot—məhsul partiyasının nömrəsi (Məhsulun hansı partiyadan gəldiyini göstərmək üçün istifadə olunur).

Bundan əlavə, biokimyəvi reagentlər sifariş edərkən CAS nömrəsi tez-tez istifadə olunur və mən onu birlikdə populyarlaşdıracağam.CAS nömrəsi Amerika Kimya Cəmiyyəti tərəfindən hər bir yeni kimyəvi dərmana verilən nömrədir.Ümumiyyətlə, üç rəqəm tire ilə birləşdirilir.Rushuinin CAS nömrəsi: 7732-18-5.Kimyəvi maddələrin çox vaxt bir neçə ləqəbi var, lakin CAS nömrəsi unikaldır.Dərman sifariş edərkən əvvəlcə onun CAS nömrəsini yoxlaya bilərsiniz.

Evə daha yaxın, niyə biz bunları aydın şəkildə təsvir etməliyik?Əslində, bu, həm də RNT çıxarılmasının keyfiyyətini yoxlamaqdır.Alətlərin və dəstlərin istifadəsi RNT ekstraksiyasını daha ardıcıl edəcək.Adi laboratoriyaların ekstraksiya miqyası böyük deyil və onu dəstlərlə əldə etmək olar.

DNaz və ya RNaz müalicəsinin təfərrüatları
Floresan kəmiyyət PCR-nin vacib məsələsi DNT-nin çirklənməsinin qarşısını almaqdır və çirklənmə olduqda təcrübə aparmayın.Buna görə də, eksperimental prosesdəki DNT-nin tamamilə və tamamilə çıxarıldığını nümayiş etdirmək üçün DNT-ni emal etmək üçün istifadə etdiyiniz prosesi qeyd etmək vacibdir.sxematik diaqramla təmsil olunur.

RNT və DNT-nin sxematik diaqramı
Ümumiyyətlə, DNT-nin çıxarılması üsulu ekstraksiyadan sonra RNT-ni DNaz ilə müalicə etməkdir.Ancaq bunlar nisbətən köhnə üsullardır.Kommersiya RNT ekstraksiya dəstləri ekstraksiya prosesi zamanı DNaz əlavə etmədən DNT-ni çıxara bilmişdir.Məsələn, Foregene-dən bir sıra dəstlər .

Qeyd: RNT hasilatı zamanı DNT-nin çıxarılması çox təhlükəli ikitərəfli qılıncdır, bu, RNT ekstraksiyasının işləmə müddətini uzadacaq və RNT-nin deqradasiyası riskini artıracaq.Əsasən, bu, RNT məhsuldarlığı və təmizlik arasında bir mübadilədir.

Bundan əlavə, silisium əsaslı adsorbsiya sütununa əlavə edilən DNase miqdarı çox azdır və effekt əldə etmək üçün yüksək keyfiyyətli DNase istifadə edilməlidir.Optimallaşdırılmamış DNaz tez və tam həzm oluna bilməz.Bu, tacirin texniki səviyyəsinin sınağıdır.Əlbəttə ki, DNT-nin DNaz olmadan çıxarıla biləcəyi ilə öyünən daha qəribə tacirlər var.Demək olar ki, DNT-ni DNase olmadan tamamilə çıxarmaq olar deyə öyünən hər kəs xuliqandır.DNT nisbətən sabit iki zəncirli quruluşdur və onu sadəcə danışmaq və gülməklə silmək olmaz.

Çirklənmənin qiymətləndirilməsi
qiymətləndirmə üsulu: elektroforez aşkarlanması, 1% agaroza, 6V/sm, 15dəq, yükləmə 1-3 ul

Nuklein turşusunun kəmiyyət analizi
adətən ultrabənövşəyi spektrofotometrdən istifadə etməklə ölçülür.İcazə verin, əvvəlcə OD260, OD280 və OD230-un üç dəyərinin mənasını populyarlaşdırım.
·OD260nm: Bu, nuklein turşusunun ən yüksək udma zirvəsinin udulma dalğa uzunluğudur və ən yaxşı ölçülmüş dəyər 0,1 ilə 1,0 arasında dəyişir.Əgər belə deyilsə, nümunəni diapazona gətirmək üçün seyreltin və ya konsentrə edin.
·OD280nm: Zülal və fenolik maddələrin ən yüksək udulma zirvəsinin udma dalğa uzunluğudur.
·OD230nm: Karbohidratların ən yüksək udma zirvəsinin udma dalğa uzunluğudur.

Sonra, hər bir göstəricinin rolu haqqında danışaq.A260 üçün, nuklein turşusunun məhsuldarlığını ölçmək üçün istifadə edilə bilər.OD260=1 olduqda, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNT=40μg/ml.

Təmizlik üçün tez-tez gördüyümüz nisbətlərə baxmalıyıq: OD260/280 və OD260/230.
·Saf DNT: OD260/280 təxminən 1,8-ə bərabərdir.1,9-dan çox olduqda RNT çirklənməsinin, 1,6-dan az olduqda isə zülal və fenol çirklənməsinin olduğunu göstərir.
· Saf RNT: 1.7
·OD260/230: DNT və ya RNT olmasından asılı olmayaraq, istinad dəyəri 2,5-dir.2.0-dən az olduqda şəkər, duz və üzvi maddələrin çirklənməsinin olduğunu göstərir.

RNT bütövlüyü

RNT-nin bütövlüyünü ölçmək çox vacibdir.Ümumiyyətlə, 28S və 18S RNT arasındakı parlaqlığın ikiqat əlaqə olub-olmadığını yoxlamaq üçün RNT denaturasiya geli təcrübəsi aparmaq lazımdır.Üçüncü zolaq 5S görünəndə, bu, onurğasızlar istisna olmaqla, RNT-nin parçalanmağa başladığını bildirir.

RNT keyfiyyətinin qiymətləndirilməsi üçün məlumatlar: Yuxarıdakı testlərə əlavə olaraq, RNT-nin görünməz şəkildə pozulduğunu aşkarlaya bilən Experion avtomatik elektroforez sisteminin RQI bütövlüyü testi kimi RNT bütövlüyü baxımından daha təkmil alət testləri də mövcuddur.

Elmi tədqiqatda flüoresan kəmiyyət PCR hədəf gen ilə daxili istinad geninin müqayisəsidir.Buna görə də, RNT nümunəsinin qorunması, RNT çıxarılması və s. prosesində əsas məqsəd RNT-nin bütövlüyünü təmin etməkdir.

RNT-nin bütövlüyünün hədəf gen ilə daxili istinad geni arasındakı tarazlığa necə təsir etdiyini aşağıdakı şəkildən asanlıqla başa düşmək olar.Deqradasiya gen natamamlığına gətirib çıxaracaq, istər daxili istinad genin natamam olması, istərsə də hədəf genin natamam olması məlumatlara böyük təsir göstərəcək.

Hədəf genin və istinad geninin sxematik diaqramı doğru olmamalıdır

İnhibisyon testi (CT dəyərinin yüksək və ya aşağı konsentrasiyada və ya digər şərtlərdə basdırılıb-bağlanmaması)

Bu rəqəmi nümunə götürsək, beş əyrinin Ct qiymətləri aşağıdakı kimidir.KT dəyərlərinin əyrilər arasında paylanması qeyri-bərabərdir və yüksək və aşağı konsentrasiyalarda Ct dəyərləri gecikir, bu da PCR inhibəsi halıdır.

Əsas məqam: RNT-nin çıxarılması prosesində yanlış təsəvvürlərdən imtina edib düzgün olanları yaratmalıyıq.

Səhv fikir belədir: RNT çıxarılması yalnız məhsulun arxasınca düşür, əldə edilən RNT miqdarı nə qədər çox olarsa, bir o qədər yaxşıdır.Əslində, biz kəmiyyət hesablama apararkən, genlərin sayı çox deyilsə, çox RNT-yə ehtiyacımız yoxdur.Çıxardığınız RNT miqdarı kifayət qədər çoxdur.

Düzgün konsepsiya belədir:RNT hasilatı saflıq, bütövlük və tutarlılığa riayət etməlidir.Saflıq sonrakı tərs transkripsiyanın maneə törədilməyəcəyini və məlumatların DNT tərəfindən təsirlənməyəcəyini təmin edə bilər.Dürüstlük hədəf ardıcıllığı və daxili istinadların balansını təmin edir.Ardıcıllıq nümunənin sabit yüklənməsini təmin edir.

MIQE (4) – əks transkripsiya
Yanlış fikir: daha yüksək nümunə həcminin axtarışı.
Düzgün konsepsiya: Yüklənmiş RNT-nin miqdarından asılı olmayaraq ardıcıllığa (sabitliyə) əməl edin, əks transkripsiyanın effektivliyi ardıcıl olaraq qalır və cDNA-dakı fərqlərin mRNT-dəki fərqləri həqiqətən əks etdirə bilməsini təmin edir.
Bu prosesi sxematik diaqramla izah edirik:

Əks transkripsiyanın səmərəliliyinin sxematik diaqramı doğru deyil
Hər şeydən əvvəl, əks transkripsiya prosesi ilə PCR prosesi arasındakı fərqi başa düşməliyik.PCR çoxlu isitmə və yumşalma proseslərinə məruz qalır və hədəf fraqment eksponent olaraq böyüyür;əks transkripsiyada bu proses olmasa da, əks transkripsiyanın əslində bir-bir olduğunu təsəvvür edə bilərik Replikasiya prosesi zamanı çoxlu RNT parçaları

cDNT Məlumatı nə qədər çox olarsa, onu indiyə qədər başa düşmək lazımdır, çünki böyük və kiçik fraqmentlər tərs transkripsiya edilmişdir və bir fraqmentə diqqət yetirmək mümkün deyil.Və RNT-nin miqdarı nisbətən kiçik olduğundan, alınan cDNA-nın miqdarı da gücləndirmə effektinə malik olan PZR-dən fərqli olaraq nisbətən kiçikdir, ona görə də onu aşkar etmək əsasən mümkün deyil.

cDNT elektroforezi nəticələri
İkincisi, ideal olaraq tərs transkripsiya tək-tək həyata keçirilir, lakin heç bir şirkətdən heç bir əks transkriptaz bu effekti əldə edə bilməz.Əsasən, əksər tərs transkriptazların effektivliyi 30-50% arasında dəyişir.Əgər belədirsə, biz nisbətən sabit tərs transkripsiyanın effektivliyinə malik olmağı üstün tuturuq ki, bunu şəkildə görmək istəyirik: 3 RNT 2 cDNA, 6 RNT 4 cDNA alır, buna görə də nə qədər nümunə yüklənməsindən asılı olmayaraq, tərs transkripsiyanın effektivliyi nisbətən sabitdir.Biz tərs transkripsiyanın effektivliyinin qeyri-sabit olduğu və yüksək konsentrasiyanın maneə törədildiyi vəziyyəti görmək istəmirik.

Beləliklə, əks transkripsiyanın səmərəliliyinin sabit olub olmadığını necə yoxlamaq olar?Metod çox sadədir, sadəcə bir müqayisə testi etmək lazımdır: biri RNT-nin ikiqat qatılmasından sonra cDNT-yə tərs transkripsiya etmək, digəri isə cDNT-yə əks transkripsiyadan sonra ikiqat qatılma etmək və sonra əldə edilən yamacın uyğun olduğunu görmək üçün qPCR etməkdir.Ən yaxşı tələbə kimi bunu saniyələr ərzində başa düşməlisiniz.Aşağıda göstərildiyi kimi:

Əks transkripsiyanın effektivliyinin sabit olub-olmadığını yoxlamaq üçün RNT və cDNA-nın seyreltilməsi
Əks transkriptaza və dəst
Necə mükəmməl floresan kəmiyyət PCR əla əks transkriptaza və dəst ola bilər.Mənbəyə görə tərs transkriptaza təxminən iki növə bölünür, AMV və yaM-MLV, və onların performansı cədvəldə göstərilənlə eynidir.

RNase H fəaliyyəti
RNase H Ribonuclease H, Çin adı ribonuclease H-dir, bu, DNT-RNT hibrid zəncirində RNT-ni xüsusi olaraq hidrolize edə bilən endoribonükleazadır.RNase H tək və ya iki zəncirli DNT və ya RNT-də fosfodiester bağlarını hidroliz edə bilməz, yəni tək və ya ikizəncirli DNT və ya RNT-ni həzm edə bilməz.Adətən cDNT-nin ikinci zəncirinin sintezində istifadə olunur.

Qəribə bir şeydir.Biz deyirik ki, əks transkriptaza RNase H aktivliyinə malikdir, əks transkriptaza RNase H ehtiva etmir və RNase H-ni əks transkriptazadan ayırmaq mümkün olmaya bilər, bəlkə də əks transkriptazada müəyyən qrupların uyğunlaşması səbəbindən Bu fəaliyyət əks transkriptaza səbəb olur.

Buna görə də, AMV-nin daha yüksək tərs transkripsiya effektivliyindən asılı olmayaraq, onun RNase H aktivliyi cDNT-nin məhsuldarlığını azaldır.Əlbəttə ki, reagent istehsalçıları cDNA məhsuldarlığını artırmaq üçün əks transkriptazada RNase H aktivliyini mümkün qədər aradan qaldırmaq üçün məhsullarını daim optimallaşdırırlar.
Yuyulma temperaturu

Müxtəlif temperaturlarda RNT-nin ikincil quruluşu
Müxtəlif temperaturlarda RNT-nin ikincil strukturu üçün yuxarıdakı rəqəmə baxın və xüsusi temperatur və duz konsentrasiyası şəraitində hədəf fraqmentin ikincil strukturunu müəyyən etmək üçün mFold onlayn alətindən istifadə edin.55°C-də RNT-nin ikincil strukturu hələ də çox mürəkkəbdir, əks transkriptaza işləyə bilmir və ikincili struktur 65°C-ə qədər tam həll oluna bilməz, halbuki AMV və M-MLV-nin optimal temperaturu bu temperaturdan çox aşağıdır.
nə etməli?İkinci dərəcəli struktur şablonun özünün tamamlayıcı cütləşməsidir ki, bu da primer və əks transkriptaza və şablon arasında güclü rəqabətə gətirib çıxarır, nəticədə aşağı E və zəif təkrarlanma kimi bir sıra problemlər yaranır.

nə etməli?Yalnız yumşalma temperaturunu mümkün qədər artırın.

Bir çox reagent istehsalçıları gen mühəndisliyi vasitəsilə tərs transkriptazalarını təkmilləşdirirlər.Bəziləri, məsələn, Jifan və Aidelai kimi reaksiya temperaturunu artırır, bəziləri isə ferment və RNT şablonu arasındakı yaxınlığı yaxşılaşdırmaq üçün RNase H fermentinin aktiv qrupunu çıxarır.Yüksək yaxınlıq ikincil quruluşu rəqabətli şəkildə sıxışdıra və rəvan oxuya bilər, həmçinin əks transkripsiyanın səmərəliliyini əhəmiyyətli dərəcədə artıra bilər.
Əsas məqam: Əks transkripsiya yüklənmiş nümunənin miqdarından daha çox tərs transkripsiyanın səmərəliliyinin ardıcıllığına nail olmaq üçün daha vacibdir (fermentlər yalnız effektiv deyil, həm də sabit olmalıdır), əgər bu xüsusilə geniş miqyaslı floresan kəmiyyət PCR deyilsə, bu, ümumiyyətlə mümkün olmayacaqdır.Çoxlu cDNA.
Müxtəlif istehsalçılar da ardıcıllığa nail olmaq üçün müəyyən səylər göstərmişlər.Məsələn, əksər şirkətlər indi tərs transkripsiyanı satış üçün standart dəst kimi qablaşdırıblar ki, bu da yaxşı seçimdir.
Məsələn, Foregene-nin RT Easy Series dəstləri:

RT Easy I (ilk zəncir cDNA sintez dəsti üçün master premiks)

MIQE (5) – hədəf gen məlumatı

Yuxarıdakı rəqəm izah edir
1. Bu genin təkrar təcrübələr üçün effektiv olub-olmaması ümumiyyətlə təkrar təcrübələrlə yoxlanıla bilər.
2. Gen ID, bilirsiniz.
3. Gen uzunluğu, hədəf genin ümumi uzunluğu qətiliklə problem deyil.Primerləri tərtib edərkən, gücləndirmənin daha yaxşı effektivliyini təmin etmək üçün amplikonun uzunluğunun 80-200bp arasında olmasını təmin edin.
4. Sequence Blast müqayisə məlumatı, qeyri-spesifik gücləndirmənin qarşısını almaq üçün hədəf genin genbankda müqayisə edilməsi lazımdır.
5. Pseudogenlərin olması.Pseudogen normal genə bənzər, lakin normal funksiyasını itirən DNT ardıcıllığıdır.Çox vaxt eukariotların çox genli ailəsində mövcuddur.Adətən ψ ilə təmsil olunur.Bu, kodlaşdırıcı gen ardıcıllığına çox oxşar olan genomdakı funksional olmayan genomik DNT nüsxəsidir., ümumiyyətlə transkripsiya edilmir və aydın fizioloji mənası yoxdur.
6. Primerlərin ekzon və intronlara nisbətən yeri.İlk illərdə, DNT-nin çirklənməsi problemini həll etdiyimiz zaman, biz tez-tez primerlərin, ekzonların və intronların mövqelərinə diqqət yetirirdik və ümumiyyətlə DNT gücləndirilməsinin qarşısını almaq üçün intronlar arasında primerlərin dizaynını düşünürdük.Zəhmət olmasa, aşağıdakı şəklə baxın: qara intronlar, müxtəlif mavilər eksonları, çəhrayı ümumi primerləri, parlaq qırmızı isə intron əhatə edən primerləri təmsil edir.

Sxematik, heç vaxt doğru deyil
Bu nə qədər mükəmməl bir plan kimi görünür, amma əslində əksər hallarda trans-intron primerləri təsəvvür edilən qədər sehrli deyil və onlar həm də qeyri-spesifik gücləndirməyə səbəb olacaqlar.Beləliklə, DNT-nin çirklənməsinin qarşısını almağın ən yaxşı yolu DNT-ni tamamilə çıxarmaqdır.
7. Konformasiyanın proqnozlaşdırılması.Yenidən bu nümunədən istifadə edərək, xüsusi temperaturda və duz konsentrasiyasında hədəf fraqmentin ikinci dərəcəli strukturunu müəyyən etmək üçün mFold onlayn alətindən istifadə edin.

Müxtəlif temperaturlarda RNT-nin ikincil quruluşu
İkinci dərəcəli struktur şablonun özünün tamamlayıcı cütləşməsidir ki, bu da primer və şablon cütləşməsi arasında güclü rəqabətə səbəb olacaq və primerin bağlanma şansı daha azdır, nəticədə aşağı E və zəif təkrarlanma kimi bir sıra problemlər yaranır.Proqram təminatının proqnozlaşdırılması vasitəsilə, əgər ikinci dərəcəli struktur problemi yoxdursa, bu, əla olardı.Əgər varsa, sonrakı məqaləmiz bu problemin necə həll olunacağını xüsusi olaraq müzakirə edəcək.

MIQE (6)—qPCR oliqonukleotidləri

Floresan kəmiyyət PCR üçün hər gün mübarizə apardığınız ilk şey RNT çıxarılması, ikincisi isə primer dizaynı ola bilər.
Əvvəla, biz hələ də MIQE yoxlama siyahısına uyğun olaraq primer dizaynı ilə bağlı qaydaları yoxlayırıq.Bu o qədər sadədir ki, şıltaqlar gülə bilər və biz bunu bir cümlə ilə bitirə bilərik: primer zondunun ardıcıllığını və mövqeyini və modifikasiya üsulunu öyrənin.Primer təmizləmə üsulu üçün primer sintezi hazırda o qədər ucuzdur ki, qPCR PAGE və yuxarıdakı təmizləmə üsullarına layiqdir və sintez alətinin məlumatı vacib deyil.Bir çox insanlar onilliklər ərzində primerlər edir və sintezatorun ABI3900 olduğunu bilmirlər.
Astar dizaynının prinsiplərinə gəlincə, onları əzbərləməyə ehtiyac yoxdur, çünki əksər primer dizayn proqramları və ya onlayn alətlər bu problemləri həll edə bilər (tövsiyə olunan onlayn alət primer3.ut.ee/) və astar dizaynının 99,999% -i əl ilə edilmir Baxın, müəllif bəzən gündə yüzlərlə primer hazırlayır, bir-bir oxusanız, çarpazlaşacaqsınız.
Astarlar hazırlandıqdan sonra aşağıdakı məqamları yoxlayın:
1. 3′ ucuna yaxın dizayn primerləri: cDNA birinci zəncirinin sintezi üçün oliqo dT primerlərindən istifadə edildiyi halda, əks transkripsiyanın effektivliyini və RNT bütövlüyünü nəzərə alaraq, gücləndirmə səmərəliliyini artırmaq üçün dizayn edilmiş primerlər 3′ sonuna yaxın dizayn edilməlidir.Aşağıdakı kimi izah etmək üçün bir şəkil istifadə edin (bunu anlamaq üçün heç bir yol yoxdur):

Niyə primerlər 3′ ucuna yaxın dizayn edilməlidir, bu doğru olmamalıdır
2. TM dəyəri: Tm dəyəri 55-65°C-dir (çünki ekzonükleaz aktivliyi 60°C-də ən yüksəkdir), GC tərkibi isə 40%-60% təşkil edir.
3. BLAST: Genomun qeyri-spesifik gücləndirilməsinin qarşısını almaq üçün Blast əlavə yoxlama üçün istifadə edilməlidir.

MIQE(7)—qPCR prosesi

1. qPCR dəsti
MIQE-nin tələblərinə uyğun olaraq, məqalədə tam reaksiya şərtlərini, o cümlədən PZR reaksiya sisteminin konfiqurasiyası, hansı dəstdən istifadə olunur, istehsalçı kimdir, reaksiya sisteminin nə qədər böyükdür, boya üsulu və ya zond metodundan istifadə edilib-edilməməsi, PCR proqramının parametrləri aydın şəkildə təsvir edilməlidir.Veteran sürücülər mütləq tapacaqlar ki, dəst seçildiyi müddətdə yuxarıda göstərilən məlumatlar əsasən müəyyən edilir.
Hazırda flüoresan kəmiyyət PCR dəstlərinin istehsalı və istehsalı çox yetkin bir texnologiyadır.Çox pis istehsalçıları seçmədiyiniz müddətcə problemlərin yaranma ehtimalı yüksək deyil, lakin biz yenə də sizinlə bir neçə məqamı bölüşmək istəyirik:
İsti başlanğıc Taq fermenti:PCR-nin ən vacib hissəsi isti başlanğıc Taq fermentidir.Bazardakı isti başlanğıc fermentləri ümumiyyətlə iki növə bölünür, biri kimyəvi cəhətdən dəyişdirilmiş isti başlanğıc fermentidir (bunu parafinin yerləşdirilməsi kimi təsəvvür edə bilərsiniz), digəri isə antikor modifikasiyası üçün isti başlanğıc fermentidir (antigen-antikor bağlaması).Kimyəvi modifikasiya fermentlərin isti işə salınmasının ilkin üsuludur.Müəyyən bir temperatura çatdıqda, ferment fəaliyyətini buraxacaq.Antikorla dəyişdirilmiş isti başlanğıc fermenti fermentin fəaliyyətini bloklamaq üçün bioloji üsullardan istifadə edir.Müəyyən bir temperatura çatdıqda, antikor zülal olaraq denatürasiya edilərək təsirsiz hala salınacaq və ferment fəaliyyəti işə salınacaq.

Ancaq bunun nə faydası var?Bu belədir, anticisim dəyişdirilmiş fermentlərin sərbəst buraxılması aktivliyi kimyəvi cəhətdən dəyişdirilmiş fermentlərə nisbətən daha sürətlidir, buna görə də həssaslıq baxımından antikor dəyişdirilmiş fermentlər bir az üstünlüyə malikdir, belə ki, bazarda dəstlərdə kimyəvi cəhətdən dəyişdirilmiş fermentlər əsasən yoxdur.Əgər varsa, deməli, bu istehsalçının texnologiyası hələ minilliyin dövründə ilişib qalıb.
Maqnezium ionunun konsentrasiyası:PCR reaksiyasında maqnezium ionunun konsentrasiyası çox vacibdir.Müvafiq maqnezium ionunun konsentrasiyası Taq fermentinin fəaliyyətinin sərbəst buraxılmasına kömək edə bilər.Konsentrasiya çox aşağı olarsa, fermentin fəaliyyəti əhəmiyyətli dərəcədə azalacaq;konsentrasiya çox yüksək olarsa, ferment katalizli qeyri-spesifik gücləndirmə güclənəcəkdir.Maqnezium ionlarının konsentrasiyası həmçinin primerlərin tavlanmasına, şablonun və PCR məhsullarının ərimə temperaturuna təsir edəcək və bununla da gücləndirilmiş fraqmentlərin məhsuldarlığına təsir edəcəkdir.Maqnezium ionlarının konsentrasiyası ümumiyyətlə 25 mM-də idarə olunur.Əlbəttə ki, yaxşı bir dəst üçün maqnezium ionlarının konsentrasiyası yaxşı idarə olunmalıdır.Bəzi tacirlər reagentə maqnezium ionunun konsentrasiyasının avtomatik tənzimlənməsi effektinə nail ola biləcək bir maqnezium ionu xelatlaşdırıcı agent əlavə edirlər.
Floresan boya konsentrasiyası:Adətən istifadə etdiyimiz SYBR Yaşıl olan flüoresan boya, əsasən ikiqat zəncirli DNT-nin kiçik yivinə bağlanaraq flüoresan yaradır, çünki boyanın ikiqat zəncirli DNT-yə bağlanması qeyri-spesifikdir, yəni ikiqat zəncirli DNT onunla birləşdiyi müddətcə, floresan sistemi DNT ilə birləşə bilər. fon siqnalı yaradır.
PS: İşığa həssas xüsusiyyətlərinə görə, bazarda olan məhsullar ümumiyyətlə qəhvəyi qeyri-şəffaf sentrifuqa borularında qablaşdırılır (aşağıdakı şəkildə göstərildiyi kimi).Ancaq bu problemlə qarşılaşacaq.Nümunə götürərkən mayenin sorulduğunu görmək çətindir.Bu baxımdan, Qingke həqiqətən istifadəçi üçün ən əlverişlidir (aşağıdakı şəkildə göstərildiyi kimi) və şəffaf boru qeyri-şəffaf qalay çantaya qablaşdırılır.Sonra işıqdan qaçmaq və nümunə götürmənin rahatlığını nəzərə alaraq onu qalay çantaya qoyun.Doğru məhsul nömrəsini seçməlisiniz.TSE204 çox qənaətcil bir varlıqdır və bu, məni ot əkmək istəyinə səbəb olur.

Floresan boyanın konsentrasiyası da çox vacibdir.Konsentrasiya çox aşağı olarsa, gücləndirmə əyrisi sonrakı mərhələdə yüksəlməyəcək və mükəmməl deyil;konsentrasiya çox yüksək olarsa, bu, səs-küyə müdaxiləyə səbəb olacaqdır.Floresan kəmiyyət PCR əsasən CT dəyərindən asılı olduğundan, flüoresan boyanın konsentrasiyası düzgün tənzimlənmədikdə, aşağı nöqtə yüksək nöqtədən daha yaxşıdır.Əlbəttə ki, uyğun boya konsentrasiyası ən yaxşısıdır.

ROX: ROX boyaları yaxşı flüoresan siqnal səhvlərini düzəltmək üçün istifadə olunur.Bəzi alət istehsalçıları kalibrləmə tələb edir, digərləri isə yox.Məsələn, Thermo Fisher Scientific-in Real Time PCR gücləndirmə alətinin istifadəsi adətən 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus və s. daxil olmaqla kalibrləmə tələb edir. Ümumi dəst təlimatları onu təsvir edəcək.
Foregene-nin qPCR Mix tərkibində müxtəlif modellərdə istifadə üçün əlverişli olan ROX boyası da var.

Real Time PCR Kit-Taqman

Zəif hidrogen bağının müalicəsi: Zəif hidrogen bağlarının müalicəsi nisbətən texniki məsələdir.Heç bir şey bir çox dəstlərin təlimatlarını oxumayıb, lakin onların heç biri bu mövzunu qeyd etməyib.Əslində bu çox vacibdir.Əsasların birləşməsi əsasən hidrogen bağlarının gücündən asılıdır.Güclü hidrogen bağları normal gücləndirmədir, zəif hidrogen bağları isə qeyri-spesifik gücləndirməyə səbəb olur.Zəif hidrogen bağlarını yaxşı aradan qaldırmaq mümkün deyilsə, qeyri-spesifik gücləndirmənin qarşısını almaq olmaz.Müəllifin əhatəsində yalnız bir neçə şirkət bu problemi fərq etdi.Dəsti satın aldığınız zaman, seçmək istədiyiniz dəst üçün bu mövzuda həll yolu düşünüb-düşünmədiyinizə müraciət edə bilərsiniz.

Reaksiya həcmi: 20-50ul sistemi daha çox istifadə olunur və daha kiçik həcmlər səhvlərə səbəb ola bilər.Ümumiyyətlə, dəst təlimatları PCR reaksiya həcmlərinin istifadəsini tövsiyə edəcəkdir.Ağıllı olmayın və xərclərə qənaət etmək üçün daha kiçik həcmlərdən istifadə edin.məqsədi.Tacirlər tərəfindən tövsiyə olunan həcm həqiqətən sınaqdan keçirilmişdir və ola bilər ki, onlar kiçik həcmlərin yaratdığı səhvlər problemini həll edə bilmirlər.
2. Boru lövhəsinin istehsalçısı və məqalə nömrəsi
Hər kəs flüoresan kəmiyyət PCR prinsipini bilir.Floresans toplanması əsasən PCR borularının qapaqları vasitəsilə həyata keçirilir.PCR istehlak materiallarını seçərkən iki məqama diqqət yetirin: yaxşı işıq ötürülməsi və alət üçün uyğunluq.Ümumiyyətlə, əsas markaların lövhələri və boruları yaxşıdır, lakin uyğunlaşma baxımından diqqətlə seçməlisiniz, əks halda alətdən istifadə edə bilməyəcəksiniz.

4. Yüksək səviyyəli bilik

MIQE (8) — qPCR validasiyası
Bu qPCR-nin əsas prioritetidir!Burda o qədər qəhrəmanlar quma düşüb.Təbii ki, şanslı olduğunuz və öyrəndiyiniz genlərin sadə olması da mümkündür, ona görə də külək boyunca buz mağarasında üzüb getdiniz.qPCR-nin yoxlama məlumatı məlumatların etibarlılığını yoxlamaq üçün nəzərdə tutulub.Lazımi yoxlama məlumatlarını aşağıdakı kimi sadalayırıq:

1.Spesifiklik testi
Hədəf genin gücləndirilməsinin spesifikliyi elektroforez şəklinin tək lent olub-olmadığını yoxlamaqla yoxlanılır;ardıcıllığın yoxlanılması;pik xəritəsinin tək olub olmadığını görmək üçün ərimə əyrisi;fermentin həzminin yoxlanılması və digər üsullar.
Burada, biz t diqqətƏrimə əyriləri metodundan istifadə edərək qeyri-spesifik gücləndirmənin təhlili.Ümumiyyətlə, biz primerləri tərtib edərkən məhsul parçasının ölçüsünün 80-200bp aralığında olması tələb olunur ki, bu da PCR məhsulunun ərimə temperaturunu 80-85 °C aralığında edir.Buna görə də, müxtəlif zirvələr varsa, digər qeyri-spesifik gücləndirmə məhsulları olmalıdır;zirvə 80 ° C-dən aşağı görünsə, ümumiyyətlə primer dimer hesab olunur;əgər pik 85°C-dən yuxarı görünürsə, bu, ümumiyyətlə DNT-nin çirklənməsi və ya daha çox böyük fraqmentlərin qeyri-spesifik gücləndirilməsi hesab olunur.
Qeyd: Bəzən 80°C-də yalnız bir zirvə var.Bu zaman bu konsepsiyaya əməl edilməlidir.Güman ki, gücləndirmə nəticələrinin hamısı primer dimerləridir.

Normal ərimə əyrisi (qeyri-spesifik gücləndirmə olmadan tək pik)

Problemli ərimə əyrisi (saxta zirvələrin qeyri-spesifik gücləndirilməsi)
【İş təhlili】

Əsas zirvə var, amma primer dimer ciddidir
Aşağıdakı şəkildəki tək zirvəli ərimə əyrisi mükəmməl bir təcrübə olduğunu düşünərək gözlərinizi asanlıqla aldada bilər, lakin nəticə tamamilə yanlışdır.Bu zaman ərimə temperaturuna baxmalıyıq.Pik temperatur 80 ° C-dən aşağıdır, bu tamamilə primer-dimerdir.

Hədəf fraqmenti yoxdur, bütün primer dimerləri
Budur, qardaşım dayana bilməz.Aşağıdakı şəkil bir əclafın mənə göndərdiyi mobil telefonla çəkilmiş şəkildir.Onun istifadə etdiyi reagentlər sənayedə çox istifadə olunan markalardır.O, bir T-prefiks markasından digər T-prefiks markasına dəyişdi.Məncə, siz artıq təxmin etmisiniz.Pis adam mənə qışqırdı: “Birinci şəkildə istifadə olunan reagent çox yaxşıdır, zirvə isə təkdir.Daha sonra tövsiyə etdiyiniz reagentdən istifadə etdikdən sonra o, qarışıq piklərlə ikinci şəkildəki kimi olur.Məni bədbəxt etdin."
İki qrafiki ayırın.İlk baxışdan birinin tək zirvəsi, digərinin isə ikiqat zirvəsi var.Cəfəngiyatdır, tək bir zirvə əlbəttə yaxşıdır.Bu doğrudurmu?
Dou E-dən daha pis, iki şəkli aşağıdakı şəkildə qoysam, dərhal başa düşəcəksiniz.Əslində, bu cür mənzərə bizi asanlıqla iflic edir.Diqqətlə təhlil etdikdən sonra biz tapdıq: birinci rəqəmin zirvəsi 75 ° C-dir, bu tamamilə primer dimerdir;ikinci rəqəmin zirvəsi 75°C və 82°C-də görünür, ən azı var Məhsul görünür.

Tələbələrin rəylərinin şəkilləri
Beləliklə, əsas problem reagentlər problemi deyil, primer dizayn problemidir.Eyni zamanda bəzi böyük markaların dəmir keyfiyyəti olmadığını da sübut edir və qardaşımın daha əvvəl dediklərini də sübut edir: Sizin məqalənizi dəstəkləyən reagent markası deyil.Məhz sizin məqaləniz reagentlərin markasını gücləndirdi.Təsəvvür edin, əgər şıltaq reagentləri dəyişməsəydi, jurnala səhv məlumatlar göndəriləcək və baş verənlər faciəyə çevriləcəkdi.
2. Boş nəzarətin Ct dəyəri
İzah etməyin, boş nəzarətin Ct dəyəri varsa, bu, çirklənmə deyilmi?Bununla belə, hələ də hansı boş nəzarətin Ct dəyərinə malik olduğunu başa düşməlisiniz.Əgər NTC-dirsə, reagentin çirklənməsi kimi yad DNT var deməkdir.NRT-dirsə, bu, çıxarılan RNT-nin DNT ilə çirklənməsi deməkdir.
3. Standart əyri
Yamac və hesablama düsturu daxil olmaqla, PCR səmərəliliyi düstur vasitəsilə hesablana bilər.Mükəmməl təcrübə üçün standart əyrinin yamacının 3.32-yə, R²-nin isə 0.9999-a yaxınlaşması tələb olunur.
4. Xətti dinamik diapazon
Reaksiyanın dinamik diapazonu xəttidir.Standart əyri yaratmaq üçün istifadə olunan şablona əsasən, dinamik diapazon ən azı 5 konsentrasiya qradiyenti daxil etməli və yüksək konsentrasiya qradiyenti və aşağı konsentrasiya qradiyentlərində Ct dəyərlərinin dəyişməsinə diqqət yetirməlidir.
5. Aşkarlamanın dəqiqliyi
qPCR nəticələrində dəyişikliklər, yəni zəif təkrarlanabilirlik, yəni zəif dəqiqlik temperatur, konsentrasiya və əməliyyat daxil olmaqla bir çox amillərdən qaynaqlanır.Kopya sayı azaldıqca qPCR dəqiqliyi ümumiyyətlə daha az idarə olunan olur.İdeal olaraq eksperimental variasiya daxilində bu texniki variasiya bioloji variasiyadan fərqlənməlidir və bioloji təkrarlar qruplar və ya müalicələr arasında qPCR nəticələrindəki statistik fərqləri birbaşa həll edə bilər.Xüsusilə diaqnostik analizlər üçün saytlar və operatorlar arasında ən yaxşı analizlər arası dəqiqlik (təkrarlanabilirlik) bildirilməlidir.
6. Aşkarlama səmərəliliyi və LOD (multipleks qPCR-də)
LOD aşkar edilmiş müsbət nümunələrin 95%-nin ən aşağı konsentrasiyasıdır.Başqa sözlə, hədəf gen replikatları dəstində olan LOD konsentrasiyası uğursuz reaksiyaların 5%-dən çox olmamalıdır.Multipleks qPCR təhlili apararkən, xüsusən nöqtə mutasiyalarının və ya polimorfizmlərin eyni vaxtda aşkarlanması üçün multipleks qPCR eyni boruda çoxsaylı hədəf fraqmentlərinin dəqiqliyinin pozulmadığına dair sübut təqdim etməlidir, çoxsaylı aşkarlama və tək boru aşkarlama Effektivlik və LOD eyni olmalıdır.Xüsusilə yüksək konsentrasiyalı hədəf genləri ilə aşağı konsentrasiyalı hədəf genləri eyni vaxtda gücləndirildikdə bu problemə diqqət yetirilməlidir.
Problemlər və həll yollarıÜmumiyyətlə, qPCR sazlama prosesində tez-tez rast gəlinən problemlər aşağıdakı aspektlərə diqqət yetirir:
· qeyri-spesifik gücləndirmə
· Astar konsentrasiyasının çətin seçimi və primer-dimerlərlə problem
· Yuvlama temperaturu qeyri-dəqiqdir
·İkincil struktur gücləndirmə səmərəliliyinə təsir göstərir
qeyri-spesifik gücləndirmə
qeyri-spesifik gücləndirməbaş verir , ümumiyyətlə astar dizaynının uyğun olmadığı hesab olunur, lakin astarları dəyişdirməyə tələsmirsinizsə, əvvəlcə aşağıdakı üsulları sınaya bilərsiniz (prinsip də əlavə olunur):
· Yuvlama temperaturunu artırın – zəif hidrogen bağlarını saxlaya bilməyəcək hala gətirməyə çalışın;
·Qavlama və uzanma müddətini qısaltmaq – zəif hidrogen bağlarının yaranma şansını azaltmaq;
· Primer konsentrasiyasını azaldın – lazımsız primerlərin və qeyri-hədəf bölgələrin bağlanma şansını azaldın;
Aşağı gücləndirmə səmərəliliyi
Qeyri-spesifik gücləndirmə ilə əks vəziyyət - aşağı gücləndirmə səmərəliliyi və aşağı gücləndirmə səmərəliliyi ilə mübarizə tədbirləri bunun əksinədir:
·Qavlama və uzanma müddətini uzatmaq;
·Üç mərhələli PCR-ə keçin və yumşalma temperaturunu azaldın;
· Primer konsentrasiyasını artırmaq;
Ps: 90-cı illərdə anadan olmuş bir çox magistr tələbələri təcrübələrin necə düzəldiləcəyini öyrənmək istəmirlər və ümid edirlər ki, dəst problemi tamamilə həll edə bilər (əgər məzun olduqdan sonra tədqiqat və inkişaf etdirmək üçün bir reagent şirkətinə getmək istəyirsinizsə), əslində reagent istehsalçıları da belə düşünürlər, ümid edirəm ki, bu, axmaqlıqdır. zəif H-bağ udma amillərinin tətbiqi.Problemi asanlıqla həll etmək üçün axmaqlar hələ də zəif hidrogen bağlarını udan bir amilin olub olmadığını öyrənmək üçün reagent şirkətinin təqdimatını oxumalıdırlar.
Primer konsentrasiyasının çətin seçimi və primer-dimerlərlə problem
Metod 1: Ümumiyyətlə, qPCR üçün dəst təlimatlarında tövsiyə olunan sistemlər və tövsiyə olunan primer konsentrasiyaları var.
Metod 2: Primer konsentrasiyası qradiyentini təyin etməklə sazlama.Aşağıdakı şəkil göstərmək üçün bir şirkətdən oğurlanıb.Aşağıdakı rəqəm üç primer konsentrasiyası qradiyenti (100nM, 250nM, 500nM) və dörd şablon konsentrasiyası qradiyenti (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng) ilə hazırlanmış flüoresan kəmiyyət nəticələrini göstərir.Təcrübə nəticələrinin Ct dəyəri aşağıdakı kimi qurulur:

Primer Konsentrasiya Seçimi Hər bir primer konsentrasiyasını aşağıdakı kimi bir xəttə birləşdirin:

Primer konsentrasiyasının seçimi göz qabağındadır, 100nM və 250nM primer konsentrasiyasının xətti əlaqəsi daha yaxşıdır və 500nM primer konsentrasiyasının xətti əlaqəsi nisbətən zəifdir.100nM və 250nM-də 250nM-in Ct dəyəri nisbətən kiçikdir, buna görə də optimal primer konsentrasiyası 250nM-dir.Ümumiyyətlə, ərimə əyrisində şiddətli primer-dimerlər görünə bilər.Əgər dizayn edilmiş primerlər primer-dimerlərdən qaça bilmirsə?
Metod 3: Astarların miqdarını azaldın və tavlama temperaturunu artırın (izah etməyə ehtiyac yoxdur).
Yuvlama temperaturunun empirik dəyəri 60°C-dir.Əmin deyilsinizsə, daha uyğun tavlama temperaturunu necə seçmək olar?Cavab primer konsentrasiyasının seçimi ilə eynidir -gradient testi.Problemi göstərmək üçün Bio-rad şirkətindən bir şəkil çəkin.Müəyyən bir hədəf parçasının gücləndirilməsi üçün hər biri üç təkrarlanan səkkiz temperatur qradiyenti təyin edin və əldə edilən gücləndirmə əyrisi aşağıdakı kimidir:

yumşalma temperaturu seçimi:
·70°C, 69°C—Əsasən, primerlər birləşdirilə bilməz, ona görə də gücləndirmə yoxdur.
·67,3°C – Başlanğıcda az miqdarda gücləndirmə var və Ct dəyəri nisbətən böyükdür.
·64,5°C——Ct dəyəri azalır.
·60.7°C, 58.0°C, 56.2°C və 55.0°C-də Ct dəyərləri əsasən sabit olmağa meylli idi, lakin son flüoresans dəyərləri fərqli idi.
Necə seçmək olar?Prinsip: Birinci prinsip daha yüksək Ct dəyəridir.Eyni Ct dəyəri üçün, dimerləşmə və qeyri-spesifik gücləndirmənin qarşısını almaq üçün daha yüksək tavlama temperaturu seçin.55 ° C-də daha yüksək flüoresan dəyəri olmasına baxmayaraq, onun içində dimerlər və ya qeyri-spesifik gücləndirmə ola bilər.
Ancaq sizin qədər ağıllısınızsa, mütləq düşünəcəksiniz: Məntiqlə desək, PCR reaksiyası çox spesifikdirsə, primer konsentrasiyası minimum tələbi aşdıqca, yüksək və aşağı nöqtələrin heç bir təsiri olmamalıdır, eynilə flüoresan boyalar və dNTP-lər kimi.Həqiqətən, yumşalma temperaturu düzgün optimallaşdırıldıqca, primer konsentrasiyasının Ct dəyərinə təsiri təbii olaraq minimuma endiriləcəkdir.

Yuvlama temperaturu düzgün optimallaşdırılır və primer konsentrasiyasının KT-yə təsiri minimuma endirilir
İkinci dərəcəli quruluş gücləndirmə səmərəliliyinə təsir göstərir
Problemi izah etmək üçün Bio-raddan şəkli götürək.O, həmçinin ikinci dərəcəli strukturu olan geni gücləndirmək üçün temperatur qradiyenti hazırlayır.

İkinci dərəcəli quruluş meydana çıxır
Görünür ki, temperatur qradiyenti azaldıqca məhsullar görünməyə başlayır və Ct dəyəri irəliləyərək 60,7°C-də minimum qiymətə çatır və sonra temperatur qradiyenti azaldıqca Ct qiyməti daha böyük olur.Əksinə, temperatur artdıqca, ikincil struktur açılır və gücləndirmə səmərəliliyi artır.Müəyyən bir temperatura çatdıqdan sonra temperaturun artırılması gücləndirmə səmərəliliyini artıra bilməz.Çünki bu anda astarlar sabit şəkildə birləşdirilə bilməz.Buna görə də,ən aşağı Ct dəyəri olan temperaturu axtarın, ikinci dərəcəli struktur şablonunu gücləndirmək üçün ən yaxşı temperaturdur!Əlbəttə ki, ağıllı axmaqlar bilməlidirlər ki, lazım deyilsə, primerləri dəyişdirmək və ikincil struktur bölgəsindən qaçmaq yaxşıdır.
5. Tətbiq səviyyəsi
MIQE - Məlumatların Təhlili

Məlumatların təhlili əsasən flüoresan kəmiyyət PCR cihazı ilə verilir.Əvvəlki məqalədə eksperimentin dizaynında izah edilən boş nəzarət kimi bir çox məlumat təhlili işi aparılmışdır.Daxili istinad genləri, təkrar nömrələri və s. aydınlaşdırılıb., burada biz əsasən qPCR tətbiqini izah edirik.
qPCR geniş istifadə olunur və eksperimental yoxlama və nuklein turşusu diaqnostikası ən çox istifadə edilən ssenarilərdir.
mütləq kəmiyyət göstəricisi
Log (ilkin konsentrasiya) dövrlərin sayı ilə xətti əlaqəyə malikdir.İlkin surət nömrəsi məlum olan standartdan standart əyri çəkilə bilər, yəni gücləndirmə reaksiyasının xətti əlaqəsi alına bilər.Nümunənin Ct dəyərinə görə nümunədəki konsentrasiya hesablana bilər.Daxil ediləcək şablonların miqdarı.

Mütləq Kəmiyyət Hesablama Metodu
Mütləq kəmiyyət standart əyriyə əsaslanmalıdır.Standart əyri etmək üçün standart tələb olunur.Adətən, standart hədəf genin klonlanması ilə əldə edilən plazmiddir.Niyə plazmiddir?Çünki dairəvi plazmid DNT ən stabildir.Standart məhsulu ikiqat nisbətə (10 qat qatılma) uyğun olaraq 5-6 gradientdə seyreltin və seyreltmə zamanı vahidliyə diqqət yetirin.Ct dəyəri 15-30 arasında olsun.

Standart hazırlıq
Eyni zamanda, sınaqdan keçiriləcək nümunə də müvafiq olaraq seyreltilməlidir (seyreltmə əmsalını yadda saxlayın) və Ct dəyəri də 15-30 arasında olmalıdır.Standart məhsul + sınaqdan keçiriləcək nümunə birlikdə maşına qoyulur.Qaçışdan sonra standart maddə ilə standart əyri düzəldildi və konsentrasiyanı hesablamaq üçün sınaqdan keçiriləcək nümunələr standart əyriyə gətirildi.
Hepatit B virusu HBV-nin kəmiyyəti tipik mütləq kəmiyyətdir və 1 ml qanda virusun surətinin sayını hesablaya bilir.
Surət nömrəsinin hesablanması
Sınaq ediləcək nümunə konsentrasiyası (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × seyreltmə əmsalı
Nümunənin molekulyar çəkisi = əsasların sayı × 324
Sınaq ediləcək nümunənin nüsxə nömrəsi (nüsxə/ul) = sınaqdan keçiriləcək nümunənin konsentrasiyası / nümunənin molekulyar çəkisi × 6 × 1014

Kopya nömrəsinin hesablanması üsulu

Yuxarıdakılar kəmiyyətin müəyyən edilməsi üçün hesablama üsuludur.Bu, orta məktəbi bitirdikdən sonra həll edilə bilən riyazi məsələdir və riyazi məsələlər ümumiyyətlə kompüterlər tərəfindən həll edilir.Əgər başa düşmürsənsə, ünsiyyət üçün gələ bilərsən.
nisbi kəmiyyət
Nisbi kəmiyyət göstəricisi əsasən elmi tədqiqatlarda istifadə olunur.1ml qanda neçə virus var və bu, DNT virusudur, bu nisbətən deterministik bir hadisədir: qanın miqdarı müəyyən edilə bilər və DNT virusu nisbətən sabitdir.Bununla belə, yarpaqda müəyyən bir genin transkripsiya nüsxələrinin sayını müqayisə etmək bizim üçün çətindir, çünki yarpağın ölçüsünü, çəkisini və həssaslığını müəyyən etmək çətindir, çıxarılan RNT-nin miqdarını müəyyən etmək çətindir və əks transkripsiyanın effektivliyini müəyyən etmək də çətindir , yəni hər hansı bir addım eksperimental məlumatlarda səhvlərə səbəb ola bilər və istifadə edilə bilməz.
Buna görə nisbi kəmiyyət bir element təqdim etməlidir:daxili istinad geni.
Başqa sözlə, nisbi kəmiyyət əslində hədəf gen ilə daxili istinad geni arasında müqayisədir.Eyni toxuma və eyni hüceyrə ilə müqayisədə nümunə ölçüsünün, RNT çıxarılmasının miqdarının, əks transkripsiyanın effektivliyinin və PCR səmərəliliyinin təsiri nisbətən kiçikdir.Kiçik nümunə ölçüsünə görə həm daxili istinad genləri, həm də hədəf genlər nisbətən azaldı.Ona görə də biz əvvəllər vahidliyi və sabitliyi vurğulayırdıq.
Daxili istinad genləri ümumiyyətləev təsərrüfatı genləri(təsərrüfat genləri), bütün hüceyrələrdə sabit şəkildə ifadə olunan genlər sinfinə aiddir və onların məhsulları hüceyrələrin əsas həyat fəaliyyətini təmin etmək üçün zəruridir.
Bu anlayışı qarışdırmayın.Təmizlik genləri bioloji funksiya terminləridir, daxili istinad genləri isə eksperimental texniki terminlərdir.Təmizlik genləri daxili istinad genləri kimi seçilməzdən əvvəl doğrulamadan keçməlidirlər.
Məsələn, müxtəlif toxuma hüceyrələrində onların ifadə səviyyələrini yoxlamaq üçün aşağıdakı şəkildə bir neçə təmizlik genini seçdik və aşkar etdik ki, β-2-mikroqlobulinin ifadə səviyyələri digər üç geninkindən tamamilə fərqlidir, ona görə də onlardan daxili istinad genləri kimi istifadə edilə bilməz.

Daxili istinad geninin korreksiya funksiyasını başa düşdükdən sonra daxili istinad geninin tətbiqi hesabına iki alqoritm əldə edilir.
·ikiqat standart əyri metodu
·2 – △△Ct metodu (CT dəyərinin müqayisə üsulu)
Növlərin və gen funksiyalarının öyrənilməsi ilə maraqlanırsınızsa, lütfən, alqoritmlər üzərində araşdırmalardan imtina edin və birbaşa düsturlardan istifadə edin və ya birbaşa maşınlardan istifadə edin;Əgər riyaziyyat və mühəndislik sahəsində düz adamsınızsa, lütfən, çekinmeyin.
ikili standart əyri metodu
Nəzarət nümunəsinin və sınanacaq nümunənin hədəf genini və təsərrüfat genini standart əyri vasitəsilə ölçün və sonra nisbi ifadə səviyyəsi olan hesablama düsturuna əsasən nisbi dəyəri hesablayın.
Üstünlükləri: sadə analiz, nisbətən sadə eksperimental optimallaşdırma
Dezavantaj: Hər bir gen üçün hər bir sınaq raundu standart əyri düzəltməlidir
Tətbiq: Gen ifadəsinin tənzimlənməsinin öyrənilməsində ən çox istifadə edilən və tanınan iki nisbi kəmiyyət metodundan biri
Formula aşağıdakı kimidir:

Nümunələr aşağıdakılardır:

Kəmiyyət nəticəsinə əsasən nisbi məbləği hesablayın
2 – △△Ct metodu (CT dəyərinin müqayisə üsulu)

Üstünlükləri: Standart əyri düzəltməyə ehtiyac yoxdur
Dezavantajlar: Gücləndirmənin səmərəliliyinin 100%-ə yaxın olduğu güman edilir;standart kənarlaşma < 5%, standart əyri və hər gücləndirmə arasındakı səmərəliliyin ardıcıl olduğu qəbul edilir;eksperimental şəraitin optimallaşdırılması daha mürəkkəbdir.
Tətbiq: Gen ifadəsinin tənzimlənməsinin öyrənilməsində ən çox istifadə edilən və tanınan iki nisbi kəmiyyət metodundan biri

Əlbəttə ki, gücləndirmə səmərəliliyinin mükəmməl 1 olması adətən qeyri-mümkündür. Korreksiya üsulu: Hədəf gen və istinad genin eyni gücləndirmə effektivliyinə malik olduğunu bilsək, lakin gücləndirmə səmərəliliyinin 1-ə bərabər olmadığını biliriksə, onda 2－△△Ct aşağıdakı kimi düzəldilə bilər: (1+E )－△△Ct, məsələn, ampl55 hesablansa, effektivlik düzgün hesablana bilər. 1.95－△△Ct
İndiyə qədər floresan kəmiyyət PCR ilə bağlı məzmun sona çatdı.