Məlumdur ki, mərkəzi dogmada RNT DNT və zülal ifadəsi arasında transkripsiya vasitəçisidir.DNT-nin aşkarlanması ilə müqayisədə RNT-nin aşkarlanması orqanizmlərdə gen ifadəsini daha obyektiv əks etdirə bilər.RNT-ni əhatə edən təcrübələrə aşağıdakılar daxildir: qRT-PCR, RNT-Seq və füzyon geninin aşkarlanması və s. RNT-nin özünün xüsusiyyətlərinə əsasən (RNT-nin şəkər halqası DNT-nin şəkər halqasından daha bir sərbəst hidroksil qrupuna malikdir), ətraf mühitdə çoxlu sayda RNaza ilə birləşərək, RNT DNT-dən daha qeyri-sabitdir və parçalanmaq daha asandır.Zibil daxil, zibil çölə, RNT keyfiyyəti yaxşı deyilsə, eksperimental nəticələr qeyri-qənaətbəxş olmalıdır, xüsusilə qeyri-dəqiq məlumatlar və ya zəif təkrarlanma kimi özünü göstərir.Buna görə də, RNT-nin emalına daha çox diqqət yetirilməlidir və sonrakı eksperimental məlumatların dəqiqliyini və düzgünlüyünü təmin etmək üçün keyfiyyətə nəzarət əlaqəsi də daha vacibdir.

RNT-nin keyfiyyətinə nəzarət etmək üçün ümumiyyətlə aşağıdakı ümumi istifadə olunan üsullar mövcuddur:

• Spektrofotometriya
• agaroz gel elektroforezi
• Agilent Bioanalizator
• real vaxt flüoresan kəmiyyət PCR
• Qubit floresan boyama üsulu

01 Spektrofotometriya

RNT birləşmiş ikiqat bağlara malikdir və 260nm dalğa uzunluğunda udma pikinə malikdir.Lambert-Beer qanununa görə, biz RNT konsentrasiyasını 260nm-də udma zirvəsindən hesablaya bilərik.Bundan əlavə, RNT-nin saflığını 260nm, 280nm və 230nm udma zirvələrinin nisbətinə görə də hesablaya bilərik.280nm və 230nm müvafiq olaraq zülalların və kiçik molekulların udma zirvələridir.İxtisaslı RNT təmizliyinin A260/A280 və A260/A230 nisbəti 2-dən çox olmalıdır. Əgər 2-dən azdırsa, bu, RNT nümunəsində zülal və ya kiçik molekullu çirklənmənin olduğunu və yenidən təmizlənməli olduğunu bildirir.Çirklənmə mənbələri aşağı axın təcrübələrinə təsir edəcək, məsələn, PCR reaksiyalarının gücləndirilməsinin effektivliyini maneə törətməklə, qeyri-dəqiq kəmiyyət nəticələrlə nəticələnəcək.RNT-nin saflığı sonrakı nəticələrə böyük təsir göstərir, ona görə də spektrofotometriya ümumiyyətlə nuklein turşusu təcrübələrində ilk addımda keyfiyyətə nəzarətin əvəzsiz əlaqəsidir.

Şəkil 1. Tipik RNT/DNT absorbsiya spektri

02 Agaroza gel elektroforezi

Saflıqdan əlavə, RNT-nin bütövlüyü də RNT-nin keyfiyyətini qiymətləndirmək üçün vacib göstəricilərdən biridir.RNT-nin deqradasiyası nümunədə çoxlu sayda qısa fraqmentlərə gətirib çıxaracaq, beləliklə, effektiv şəkildə aşkarlana bilən və istinad ardıcıllığı ilə əhatə oluna bilən RNT fraqmentlərinin sayı azalacaq.RNT bütövlüyünü 1% agaroz geldə ümumi RNT-nin elektroforezi ilə yoxlamaq olar.Bu üsul geli özünüz konfiqurasiya edə bilər və ya bütövlüyün yoxlanılması üçün əvvəlcədən hazırlanmış E-Gel™ Sistemindən istifadə edə bilərsiniz.Ümumi RNT-nin 80%-dən çoxu ribosomal RNT-dir, onların əksəriyyəti 28S və 18S rRNT-dən ibarətdir (məməlilər sistemlərində).Keyfiyyətli RNT müvafiq olaraq 5 Kb və 2 Kb-da 28S və 18S parlaq çubuqlar olan iki açıq parlaq çubuq göstərəcək və nisbət 2: 1-ə yaxın olacaq.Əgər o, diffuz vəziyyətdədirsə, bu, RNT nümunəsinin deqradasiyaya uğramış ola biləcəyini bildirir və RNT-nin keyfiyyətini əlavə yoxlamaq üçün daha sonra təsvir edilən metoddan istifadə etmək tövsiyə olunur.

Şəkil 2. Agaroz gel elektroforezində deqradasiya olunmuş (2-ci zolaq) və bütöv RNT-nin (3-cü zolaq) müqayisəsi

03 Agilent Bioanalizator

RNT-nin bütövlüyünü sadə və tez müəyyən etməyə kömək edə biləcək yuxarıda təsvir edilən agaroz gel elektroforez üsulundan əlavə, biz RNT-nin bütövlüyünü müəyyən etmək üçün Agilent bioanalizatorundan da istifadə edə bilərik.RNT konsentrasiyasını və bütövlüyünü qiymətləndirmək üçün mikrofluidics, kapilyar elektroforez və flüoresanlığın birləşməsindən istifadə edir.RNT nümunəsinin profilini təhlil etmək üçün daxili alqoritmdən istifadə etməklə, Agilent bioanalizatoru istinad RNT bütövlüyünün dəyərini, RNT Bütövlük Nömrəsini (bundan sonra RIN adlandırılacaq) hesablaya bilər [1].RIN-in dəyəri nə qədər böyükdürsə, RNT-nin bütövlüyü bir o qədər yüksəkdir (1-i son dərəcə pozulmuşdur, 10-u ən tamdır).RNT ilə əlaqəli bəzi təcrübələr keyfiyyətin qiymətləndirilməsi üçün RIN-dən istifadə etməyi təklif edir.Nümunə kimi yüksək məhsuldarlıqlı ardıcıllaşdırma təcrübələrini (bundan sonra NGS adlandırılacaq) götürərək, Thermo Fisher-in Oncomine panel seriyasında B hüceyrəsi və T hüceyrəsi antigen reseptorlarını aşkar etmək üçün istifadə edilən Oncomine™ İnsan İmmun Repertuarının təlimatları RIN dəyərləri 4-dən çox olan nümunələrin oxuna biləcəyini təklif edir.Fərqli panellər üçün tövsiyə olunan müxtəlif diapazonlar var və çox vaxt daha yüksək RIN daha effektiv məlumat gətirə bilər.

Şəkil 3, Oncomine™ İnsan İmmun Repertuarı təcrübələrində, RIN-i 4-dən çox olan nümunələr daha effektiv oxunuşları və T hüceyrə klonlarını aşkar edə bilər.【2】

Bununla belə, RIN dəyərinin də bəzi məhdudiyyətləri var.RIN NGS eksperimental məlumatlarının keyfiyyəti ilə yüksək korrelyasiyaya malik olsa da, FFPE nümunələri üçün uyğun deyil.FFPE nümunələri uzun müddət kimyəvi emaldan keçmişdir və çıxarılan RNT ümumiyyətlə nisbətən aşağı RIN dəyərinə malikdir.Lakin bu, eksperimentin effektiv məlumatlarının qeyri-qənaətbəxş olması demək deyil.FFPE nümunələrinin keyfiyyətini dəqiq qiymətləndirmək üçün RIN-dən başqa ölçülərdən istifadə etməliyik.RIN-ə əlavə olaraq, Agilent bioanalizatoru RNT keyfiyyətinin qiymətləndirmə parametri kimi DV200 dəyərini də hesablaya bilər.DV200, RNT nümunəsində 200 bp-dən böyük fraqmentlərin nisbətini hesablayan parametrdir.DV200 FFPE nümunə keyfiyyətinin RIN-dən daha yaxşı göstəricisidir.FFPE tərəfindən çıxarılan RNT üçün effektiv şəkildə aşkarlana bilən genlərin sayı və genlərin müxtəlifliyi ilə çox yüksək korrelyasiyaya malikdir [3].DV200 FFPE-nin keyfiyyətinin aşkarlanmasındakı çatışmazlıqları tamamlaya bilsə də, Agilent bioanalizatoru hələ də RNT nümunələrindəki keyfiyyət problemlərini, o cümlədən nümunələrdə inhibitorların olub-olmamasını hərtərəfli təhlil edə bilmir.İnhibitorların özləri aşağı axın təcrübələrinin gücləndirilməsinin effektivliyinə təsir göstərə və faydalı məlumatların miqdarını azalda bilərlər.Nümunədə bir inhibitor olub olmadığını bilmək üçün biz aşağıda təsvir olunan real vaxt flüoresan kəmiyyət PCR metodunu qəbul edə bilərik.

04 real vaxt flüoresan kəmiyyət PCR

Real vaxt rejimində flüoresan kəmiyyət PCR üsulu nümunədəki inhibitorları aşkar etməklə yanaşı, FFPE nümunəsindəki RNT keyfiyyətini də dəqiq əks etdirə bilər.Agilent bioloji analizatorları ilə müqayisədə real vaxt rejimində flüoresan kəmiyyət alətləri daha geniş tətbiqinə görə əsas bioloji laboratoriyalarda daha populyardır.RNT nümunələrinin keyfiyyətini yoxlamaq üçün biz yalnız GUSB (Cat no. Hs00939627) kimi daxili istinad genləri üçün primer zondları almalıyıq və ya hazırlamalıyıq.Mütləq kəmiyyət təcrübələri aparmaq üçün bu primerlər, zondlar və standartlar dəstindən (məlum konsentrasiyanın ümumi RNT) istifadə edərək, effektiv RNT fraqmentinin konsentrasiyası RNT keyfiyyətinin qiymətləndirilməsi standartı kimi hesablana bilər (qısaca Funksional RNT Kəmiyyəti (FRQ)).NGS testində biz RNT nümunələrinin FRQ-nun effektiv məlumat həcmi ilə çox yüksək korrelyasiyaya malik olduğunu gördük.0.2ng/uL FRQ-dən çox olan bütün nümunələr üçün oxunanların ən azı 70%-i istinad ardıcıllığını effektiv şəkildə əhatə edə bilər (Şəkil 4).

Şəkil 4, flüoresan kəmiyyət üsulu ilə aşkar edilən FRQ dəyərinin NGS təcrübəsində əldə edilmiş effektiv məlumatlarla çox yüksək korrelyasiya (R2>0,9) var.Qırmızı xətt 0,2 ng/uL-ə bərabər olan FRQ dəyəridir (log10 = -0,7).【4】

FFPE nümunələrinə tətbiq oluna bilməsi ilə yanaşı, real vaxt kəmiyyət PCR metodu nümunələrdəki inhibitorları da effektiv şəkildə izləyə bilər.Biz aşkar ediləcək nümunəni Daxili Müsbət Nəzarət (IPC) və onun Təhlili ilə reaksiya sisteminə əlavə edə və sonra Ct dəyərini əldə etmək üçün flüoresans kəmiyyətini təyin edə bilərik.Nümunəsiz reaksiyada Ct dəyəri Ct dəyərindən geri qalırsa, bu, inhibitorun nümunədə olduğunu göstərir və reaksiyada gücləndirmə səmərəliliyini maneə törədir.

05 Qubit floresan boyama üsulu

Qubit Fluorometr nuklein turşusunun konsentrasiyası və saflığın aşkarlanması üçün ən çox istifadə edilən kiçik cihazdır, istifadəsi asan və demək olar ki, hər molekulyar biologiya laboratoriyasında mövcuddur.O, aşkar edərək nuklein turşusunun konsentrasiyasını dəqiq hesablayır və nuklein turşusu bağlayan flüoresan boyadır (Qubit aşkarlama reagenti).Qubit yüksək həssaslığa və spesifikliyə malikdir və RNT-ni pg/µL konsentrasiyasına qədər dəqiq şəkildə ölçə bilir.Nuklein turşusunun konsentrasiyasını dəqiq ölçmək üçün məşhur qabiliyyətə əlavə olaraq, Thermo Fisher-in ən son yeni modeli Qubit 4.0 RNT-nin bütövlüyünü də aşkar edə bilər.Qubit 4.0 RNT aşkarlama sistemi (RNA IQ Assay) eyni vaxtda iki xüsusi flüoresan boyanı aşkar edərək RNT-nin bütövlüyünü aşkar edir.Bu iki flüoresan boyalar müvafiq olaraq RNT-nin böyük fraqmentlərinə və kiçik fraqmentlərinə bağlana bilir.Bu iki flüoresan boya nümunədə böyük RNT fraqmentlərinin nisbətini göstərir və buradan RNT keyfiyyətini təmsil edən IQ (Bütövlük və Keyfiyyət) dəyəri hesablana bilər.IQ dəyəri həm FFPE, həm də qeyri-FFPE nümunələrinə tətbiq edilir və sonrakı ardıcıllıq keyfiyyətinə böyük təsir göstərir.Nümunə olaraq NGS təcrübələrini götürsək, Ion torrent™ platformasında həyata keçirilən RNT-Seq test təcrübələrində, IQ dəyəri 4-dən çox olan nümunələrin əksəriyyətinin ən azı 50% effektiv oxunuşu var (Şəkil 5).Yuxarıda qeyd olunan aşkarlama üsulları ilə müqayisədə Qubit IQ Assay işləmək üçün daha rahatdır və daha az vaxt tələb edir (beş dəqiqə ərzində), həm də ölçülən IQ parametri ilə aşağı axın təcrübələrinin məlumat keyfiyyəti arasında böyük korrelyasiyaya malikdir.

Şəkil 5, Qubit RNT IQ dəyəri ilə RNT-Seq-in xəritələnmiş oxunuşları arasında böyük korrelyasiya var.【5】

Yuxarıdakı giriş vasitəsilə inanıram ki, hər kəs müxtəlif RNT keyfiyyətinə nəzarət üsulları haqqında kifayət qədər anlayışa malikdir.Praktikada seçə bilərsiniznümunə növünə və mövcud alətlərə uyğun olaraq müvafiq metod.Yalnız RNT keyfiyyətinə yaxşı nəzarət etməklə nümunə keyfiyyətinin aşağı olması nəticəsində yaranan sonrakı təcrübələrin uğursuzluğundan qaça bilərik, beləliklə qiymətli vaxta, enerjiyə və xərclərə qənaət edə bilərik.

İstinad məhsulları:

Heyvanların Ümumi RNT İzolyasiya Kiti

Hüceyrə Toplam RNT İzolyasiya Kiti

istinadlar

【1】Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.RIN: RNT ölçmələrinə bütövlük dəyərləri təyin etmək üçün RNT bütövlüyü nömrəsi.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Oncomine İnsan İmmun Repertuarı İstifadəçi Təlimatı (Nəşriyyat No. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Enhanced Quality Metrics for Assessing RNT Derived from Archival Formalin-Fixed Parafin-bedded Tissue Nümunələri, Toksikologiya Elmləri, Avqust 17, Cild 12, Səh. 7–373,https://doi.org/10.1093/toxsci/