Aşkarlamanın spesifikliyi
Əksər hallarda primer dizaynının məqsədi PCR-in spesifikliyini maksimum dərəcədə artırmaqdır.Bu, bir çox dəyişənlərin az və ya çox proqnozlaşdırıla bilən təsiri ilə müəyyən edilir.Mühüm dəyişənlərdən biri də primerin 3′ ucundakı ardıcıllıqdır.
Əhəmiyyətli odur ki, spesifiklik üçün nəzərdə tutulmuş PCR analizlərinin geniş dinamik diapazonda yüksək effektivliyi saxlamaq ehtimalı daha yüksəkdir, çünki təhlil qeyri-spesifik gücləndirmə məhsulları istehsal etmir, bununla da PCR reagentləri ilə rəqabət aparır və ya əsas gücləndirmə reaksiyasını maneə törədir.
Əlbəttə ki, bəzi hallarda spesifiklik ən vacib deyil, məsələn, məqsəd bir-biri ilə sıx əlaqəli, lakin müxtəlif patogenlərin kəmiyyətini müəyyən etmək olduqda, xüsusi dizayn, optimallaşdırma və yoxlama standartları tələb olunur.
Ərimə əyrisi, amplikonların spesifikliyini qiymətləndirmək üçün standart bir üsuldur, ən azı tək bir hədəfi gücləndirmək baxımından.Bununla belə, vurğulamaq lazımdır ki, ərimə əyriləri yanıltıcı ola bilər, çünki məsələn, onlara suboptimal primerlərin və aşağı şablon konsentrasiyalarının birgə təsirləri təsir edə bilər.
P5 |Ərimə əyrisi iki hədəf DNT-nin müxtəlif miqdarda iki aşkarlanması nəticəsində əldə edilən Tm sürüşmələrini göstərir.
A. Daha yüksək konsentrasiyalarda (ad)), qPCR ölçülməsi tamamlandıqdan sonra heç bir aşkar primer dimer yoxdur.Şablon konsentrasiyası 50 nüsxəyə qədər azaldıqca (e), qeyri-spesifik məhsul görünməyə başlayır və ən aşağı konsentrasiyada (f) yeganə məhsula çevrilir.
B. Test bütün hədəf konsentrasiyalarda eyni Tms qeyd etdi və hətta ən aşağı konsentrasiyada (5 nüsxə) aşkar primer dimer yox idi.Bu iki aşkarlama metodundan istifadə edərkən NTC-lərdə heç bir gücləndirici məhsul aşkar edilməmişdir.
P5 şablonun müxtəlif konsentrasiyalarda mövcud olduğu nümunələrlə əldə edilən həlletmə əyrilərini göstərir.P 5a göstərir ki, iki ən aşağı konsentrasiyada istehsal edilən qeyri-spesifik gücləndirmə məhsullarının Tms-ləri xüsusi amplikonlardan daha aşağıdır.
Aydındır ki, bu aşkarlama üsulu aşağı konsentrasiyalarda mövcud olan hədəfləri aşkar etmək üçün etibarlı şəkildə istifadə edilə bilməz.
Maraqlıdır ki, NTC-lər, yəni heç bir DNT-si olmayan nümunələr, (qeyri-spesifik) gücləndirmə məhsullarını qeyd etməmişdir, bu da fon genomik DNT-nin qeyri-spesifik gücləndirmə/polimerləşmədə iştirak edə biləcəyini göstərir.
Bəzən belə fon primerləri və qeyri-spesifik gücləndirmə aradan qaldırıla bilməz, lakin hər hansı bir şablon konsentrasiyasında və NTC-də (P 5b) qeyri-spesifik gücləndirilməsi olmayan aşkarlama metodunun layihələndirilməsi çox vaxt mümkündür.
Burada hətta Cq 35 ilə hədəf konsentrasiyanın gücləndirilməsinin qeyd edilməsi xüsusi həll əyrisini yaradacaqdır.Eynilə, NTC-lər qeyri-spesifik gücləndirmə əlamətləri göstərmədi.Bəzən aşkarlama davranışı ana likördən asılı ola bilər və müxtəlif Mg2+ konsentrasiyaları ilə əlaqəli ola bilən müəyyən tampon tərkiblərində yalnız qeyri-spesifik gücləndirmə aşkar edilir.
Aşkarlanmanın sabitliyi
Ta-nın optimallaşdırılması qPCR aşkarlanmasının empirik yoxlanılması və optimallaşdırılması prosesində faydalı bir addımdır.O, NTC-ni gücləndirmədən ən aşağı Cq-ni yaradan temperaturu (və ya temperatur diapazonunu) göstərməklə primer dəstinin möhkəmliyinin birbaşa göstəricisini təmin edir.
Həssaslıqdakı iki-dörd qat fərq yüksək mRNT ifadəsi olan insanlar üçün vacib olmaya bilər, lakin diaqnostik testlər üçün müsbət və yanlış mənfi nəticələr arasındakı fərqi ifadə edə bilər.
qPCR primerlərinin Ta xassələri çox fərqli ola bilər.Bəzi testlər çox möhkəm deyil və primerlərin optimal Ta dəyəri altında aparılmasa, onlar tez çökəcəklər.
Bu vacibdir, çünki bu tip aşkarlama real dünyada tez-tez problem yaradır və nümunənin saflığı, DNT konsentrasiyası və ya digər DNT-nin mövcudluğu optimal olmaya bilər.
Bundan əlavə, hədəf nüsxə nömrəsi geniş diapazonda dəyişə bilər və reagentlər, plastik qablar və ya alətlər testi qurarkən istifadə olunanlardan fərqli ola bilər.
P6|Temperatur qradiyenti PCR aşkarlamasının müxtəlif möhkəmliyini göstərir.
A. İnsan beyninin RNT-sindən hazırlanmış cDNA üzərində PCR yerinə yetirmək üçün Bioline şirkətinin Sensifast SYBR mastermiksindən (kataloq nömrəsi BIO-98050) istifadə edin.
B. Bio-Rad-ın CFX qPCR alətindən apalinin gücləndirmə xəritəsini və həll əyrisini qeyd etmək üçün istifadə edin (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).
C. ACSBG1-in gücləndirmə qrafiki və ərimə əyrisi (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).
D. GFAP-ın gücləndirmə qrafiki və həllolma əyrisi (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCTCGTGGATCTTC).
E. 7C temperatur qradiyenti altında qeydə alınan Cq fərqini göstərən müxtəlif yumşalma temperaturlarında qeydə alınan Cqs.
P 6 arzuolunmaz testin tipik nəticəsini göstərir, burada qPCR 59C və 67C (P 6a) arasında Tas gradientindən istifadə etməklə, insan beyninə xas üç gen üçün primerlərdən istifadə etməklə həyata keçirilib.
Gücləndirmə qrafikindən görünə bilər ki, Opalin primerləri idealdan çox uzaqdır, çünki onların optimal Ta diapazonu çox dardır (Şəkil 6b), yəni Cqs geniş yayılmışdır, nəticədə Cqs onların optimal Cqs Low ilə əhəmiyyətli dərəcədə müqayisə olunur.
Bu aşkarlama metodu qeyri-sabitdir və suboptimal gücləndirməyə səbəb ola bilər.Buna görə də, bu astar cütü yenidən dizayn edilməlidir.Bundan əlavə, ərimə əyrisinin təhlili (daxili) göstərir ki, bu aşkarlama metodunun spesifikliyi də problemli ola bilər, çünki hər Ta-nın ərimə əyrisi fərqlidir.
P 6c-də göstərilən ACSBG1 aşkarlama metodu yuxarıdakı Opalin aşkarlama metodundan daha möhkəmdir, lakin hələ də idealdan uzaqdır və çox güman ki, təkmilləşdirilə bilər.
Bununla belə, biz vurğulayırıq ki, möhkəmlik və spesifiklik arasında heç bir zəruri əlaqə yoxdur, çünki bu aşkarlama üsulu ilə əldə edilən həlletmə əyrisi bütün Tas (daxili) üçün eyni pik dəyərini göstərir.
Digər tərəfdən, möhkəmlik testi daha dözümlüdür və P 6d-də göstərilən GFAP testində olduğu kimi geniş Tas diapazonunda oxşar Cqs istehsal edir.
Eyni 8 dərəcə Selsi diapazonunda əldə edilən Cq fərqi 1-dən azdır və həll əyrisi (daxili) bu temperatur intervalında aşkarlama xüsusiyyətlərini təsdiqləyir.Qeyd etmək lazımdır ki, hesablanmış Tas və faktiki Ta diapazonu çox fərqli ola bilər.
Tədqiqatçılara səmərəli primerlər hazırlamağa kömək etmək üçün nəzərdə tutulmuş bir çox təlimatlar var, onların əksəriyyəti çoxdan müəyyən edilmiş qaydalara əsaslanır və primerlərin 3′ ucuna çox diqqət yetirilmişdir.Tez-tez 3' ucunda bir G və ya C və iki G və ya C əsasının (GC sıxacının) daxil edilməsi tövsiyə olunur, lakin son 5 əsasdan ikidən çox olmamalıdır.
Təcrübədə bu qaydalar tədqiqatçılara yol göstərə bilər, lakin bütün hallarda onlar mütləq doğru deyil.
P7 |Astarın 3′ ucunun spesifikliyə və ya səmərəliliyə çox az təsiri var.
A. İnsan HIF-1α (NM_181054.2) geni üçün primerlərin mövqeyi.
B. Altı test tapşırığını gücləndirmək üçün Agilent Brilliant III SYBR Green ana içkisindən (Kat. No. 600882) istifadə edin.
C. Bio-Rad-ın CFX qPCR aləti və 3′end primerləri tərəfindən qeydə alınan gücləndirmə qrafiki və ərimə əyrisi.NTC-lər qırmızı rənglə göstərilir.
D. Hər bir test tapşırığının Cqs qeydi
Məsələn, P 7-dəki nəticə 3′son qaydasına ziddir.Bütün dizaynlar əsasən eyni nəticələr verir, yalnız iki primer birləşməsi NTC-də qeyri-spesifik gücləndirməyə gətirib çıxarır.
Bununla belə, biz GC klipinin təsirini dəstəkləyə bilmərik, çünki bu halda A və ya T-dən maksimum 30 əsas kimi istifadə spesifikliyi azaltmır.
F primerinin GGCC-də bitdiyi C testi NTC-lərdə Cq-ları qeyd etdi ki, bu da 30-un sonunda bu ardıcıllıqlardan qaçmaq istəyə biləcəyini göstərir.Biz vurğulayırıq ki, bir primer cütünün ən yaxşı 3′end ardıcıllığını təyin etməyin yeganə yolu bəzi namizəd primerləri eksperimental olaraq qiymətləndirməkdir.
Gücləndirmə səmərəliliyi
Əhəmiyyətli odur ki, qeyri-spesifik PCR aşkarlanması heç vaxt spesifik ola bilməsə də, gücləndirmə səmərəliliyi fermenti, ana mayeni, aşqarları və dövriyyə şərtlərini dəyişdirərək bir çox müxtəlif yollarla tənzimlənə və maksimuma çatdırıla bilər.
PCR aşkarlanmasının effektivliyini qiymətləndirmək üçün hədəf nuklein turşusundan 10 və ya 5 dəfə ardıcıl seyreltmə, yəni "standart əyri üsul" istifadə etmək yaxşıdır.
Standart əyri yaratmaq üçün PCR amplikonları və ya sintetik DNT hədəfləri istifadə olunursa, bu hədəflərin ardıcıl seyreltmələri sabit miqdarda fon DNT ilə qarışdırılmalıdır (məsələn, genomik DNT).
P8 |PCR-in effektivliyini qiymətləndirmək üçün qatılma əyrisi.
A. HIF-1 üçün primerlərdən istifadə edin: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA və R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC və Agilent's Brilliant III SYBR Green mastermix (kataloq nömrəsi 600882) PCR və ərimə əyrisi şərtləri üçün.
B. 100 ng RNT əks transkripsiya edildi, 2 dəfə seyreltildi və ardıcıl olaraq seyreltilmiş cDNT nümunələri 1 ng insan genomik DNT-sinə qədər 5 dəfə seyreltildi.Ərimə əyrisi əlavədə göstərilmişdir.
C. RT reaksiyası, seyreltmə və ardıcıl seyreltmə ikinci cDNA nümunəsi üçün təkrarlandı və nəticələr oxşar idi.
P 8, iki fərqli cDNA nümunəsində eyni aşkarlama metodundan istifadə edərək iki standart əyri göstərir, nəticə eyni səmərəlilikdir, təxminən 100% və R2 dəyəri də oxşardır, yəni eksperimental məlumatlar ilə reqressiya xətti və ya verilənlər arasındakı uyğunluq dərəcəsi.
İki standart əyri müqayisə edilə bilər, lakin tam olaraq eyni deyil.Əgər məqsəd hədəfin kəmiyyətini dəqiq müəyyən etməkdirsə, qeyd etmək lazımdır ki, qeyri-müəyyənliyi izah etmədən nüsxə nömrəsinin hesablanması qəbuledilməzdir.
P9 |Standart əyridən istifadə edərək kəmiyyətin təyini ilə əlaqəli ölçü qeyri-müəyyənliyi.
A. PCR və ərimə əyrisi şərtlərini yerinə yetirmək üçün GAPDH (NM_002046) üçün primerlərdən istifadə edin.F: ACAGTTGCCATGTAGACC və R: TAACTGGTTGAGCACAGG və Bioline-nin Sensifast SYBR mastermiksi (kataloq nömrəsi BIO-98050).
B. Bio-Rad-ın CFX qPCR aləti ilə qeydə alınmış gücləndirmə qrafiki, ərimə əyrisi və standart əyri.
C. Standart əyri qrafiki və 95% etibarlılıq intervalı (CI).
D. Seyreltmə əyrisindən alınan üç Cq dəyərinin surət nömrəsi və 95% etibar intervalı.
P 9 göstərir ki, optimallaşdırılmış test üçün vahid standart əyrinin xas dəyişkənliyi təxminən 2 dəfədir (95% etimad intervalı, minimumdan maksimuma qədər), bu gözlənilə bilən ən kiçik dəyişkənlik ola bilər.
Əlaqədar məhsul:
Animal Tissue Direct PCR dəsti
Göndərmə vaxtı: 30 sentyabr 2021-ci il
