RT-qPCR təcrübəsinə RNT çıxarılması və keyfiyyətin qiymətləndirilməsi, əks transkripsiya və qPCR üç addım daxildir, hər bir addımda bir çox ehtiyat tədbirləri var, biz aşağıda ətraflı şəkildə təqdim edəcəyik.

Ⅰ.RNT keyfiyyətinin qiymətləndirilməsi

RT-qPCR təcrübəsində, RNT hasilatı başa çatdıqdan sonra, RNT-nin keyfiyyəti qiymətləndirilməlidir və təqib təcrübəsi yalnız ixtisaslı olduqdan sonra həyata keçirilə bilər.Qiymətləndirmə metodlarına spektrofotometr, Agilent gel elektroforezi, Agilent 2100 analizi daxildir ki, bunlar arasında ən çox istifadə olunan spektrofotometr və agaroz gel elektroforez metodu aşkarlanır.Qeyd etmək lazımdır ki, RNT-nin keyfiyyətini təmin etmək üçün RNT konsentrasiyasının, saflığının və bütövlüyünün aşkarlanması və təhlilini başa çatdırmaq üçün bu iki üsul birlikdə istifadə edilməlidir.

Əlaqədar RNT İzolyasiya Kiti: 

Hüceyrə Toplam RNT İzolyasiya Kiti

11 dəqiqə ərzində müxtəlif mədəni hüceyrələrdən yüksək təmizlənmiş və yüksək keyfiyyətli ümumi RNT əldə edilə bilər.

Heyvanların Ümumi RNT İzolyasiya Kiti

Müxtəlif heyvan toxumalarından yüksək təmizlik və yüksək keyfiyyətli ümumi RNT-ni tez və səmərəli şəkildə çıxarın.

Spektrofotometr:

Spektrofotometr əsasən RNT-nin konsentrasiyasını və saflığını təyin etmək üçün istifadə olunur, lakin RNT-nin və genomik qalığın bütövlüyünü aşkar edə bilmir.Onların arasında A260/280 və A260/230 RNT təmizliyinin aşkarlanması üçün vacib parametrlərdir və RNT təmizliyi onların dəyərlərinin dəyişməsinə görə aşkar edilə bilər:

1. 1,9< A260/280< 2,1, RNT təmizliyinin yaxşı olduğunu göstərir;A260/280<1.9, RNT-də zülal qalıqlarının ola biləcəyini göstərir;A260/280>2.1, RNT-nin mümkün qismən deqradasiyasını göstərir və bu, agaroz gel elektroforezi ilə daha da təsdiqlənə bilər.

2. 2.0< A260/230< 2.2, RNT təmizliyinin yaxşı olduğunu göstərir;A260/230< 2.0, RNT-də fenollar, etanol və ya şəkərlər kimi üzvi reagentlərin qalıqlarının ola biləcəyini göstərir.

Agaroz gel elektroforezi:

Agaroz gel elektroforez analizi RNT bütövlüyünü, genomu və zülal qalıqlarını təhlil edə bilər, lakin RNT konsentrasiyasını dəqiq ölçə və ya üzvi reagentlərin qalıqlarını aşkarlaya bilməz.Məsələn, eukaryotik RNT şablonlarını götürün:

1. RNT agaroz gel elektroforezinə məruz qaldı.Əgər gel xəritəsində 28sRNA, 18sRNA və 5.8sRNA-dan ibarət yalnız üç tək zolaq var idisə, bu, çıxarılan RNT-nin bütöv olduğunu göstərir.Əgər sürükləmə fenomeni varsa, bu, RNT-nin qismən deqradasiyasını göstərir.

2. Yapışqan dəliyi ilə 28sRNA zolağı arasında tək parlaq zolaq varsa, genomik DNT qalığı ola bilər.

3. Yapışqan çuxurunda lentlər görünsə, bu, zülal və digər makromolekulyar maddələrin qalıqlarının ola biləcəyini göstərir.

Ⅱ. Əks transkripsiya

RNT hasilatı tamamlandıqdan sonra onun sonrakı təcrübələr üçün cDNA-ya çevrilməsi lazımdır, ona görə də geri çevrilmə mərhələsi vacibdir.Tərs transkripsiya əks transkriptaza və primer seçimindən təqdim ediləcək:

Əks transkriptaza seçimi:

Tipik əks transkriptazalara AMV RTase və MMLV RTase daxildir.AMV RTase-nin RNase H güclü aktivliyə, qısa sintez uzunluğuna, aşağı sintez miqdarına və yaxşı istilik sabitliyinə (42 ~ 55 ℃) malikdir.MMLV RTase-nin RNase H aktivliyi zəifdir, sintez uzunluğu uzun, sintez miqdarı yüksəkdir və istilik sabitliyi zəifdir (37 ~ 42 ℃).

RNase H fermenti RNT şablonunu deqradasiya etmək funksiyasına malik olduğundan, əks transkripsiya zamanı zəif RNase H aktivliyi olan MMLV üstünlüklə seçilməlidir və sonrakı genetik mühəndislikdən sonra MMLV-nin istilik sabitliyi keyfiyyətcə sıçrayışa çatmışdır.Foregene alaraqForeasy Reverse Transkriptaza (əks transkripsiya üçün M-MLV) Nümunə olaraq, genetik rekombinasiya texnologiyasından istifadə edərək E. coli tərəfindən hazırlanmış bakteriyalarda ifadə edilən yeni tərs transkriptazadır.Bu, tək zəncirli RNT, DNT və ya RNT:DNT hibridindən tamamlayıcı DNT zəncirini sintez edən rekombinant DNT polimerazadır.Onun RNase H aktivliyi yoxdur, güclü sabitlik, güclü RNT yaxınlığı və yüksək aşkarlama həssaslığı var.

 

Foreasy Reverse Transkriptaza (əks transkripsiya üçün M-MLV)

Astar seçimi:

Ümumiyyətlə RT primerləri üç kateqoriyaya bölünür: oliqo dT, təsadüfi primerlər və gen-spesifik primerlər.Müxtəlif eksperimental tələblərə uyğun istifadə üçün uyğun primerləri seçin.

1. Şablon eukaryotik mənşəlidirsə və gec cDNT müntəzəm PCR gücləndirilməsi üçün istifadə olunursa, Oliqo (dT) tövsiyə olunur;Sonrakı təcrübə yalnız qPCR üçün istifadə edilərsə, əks transkripsiyanın səmərəliliyini artırmaq üçün Oligo (dT) təsadüfi primerlərlə qarışdırmaq tövsiyə olunur.

2. Şablon prokaryotlardandırsa, əks transkripsiya üçün Təsadüfi Primerlər və ya gen spesifik primerlər seçilməlidir.

Ⅲ.qPCR

Floresansın kəmiyyəti əsasən kəmiyyət üsullarının seçimindən, primer dizayn prinsiplərindən, ROX seçimindən, reaksiya sisteminin konfiqurasiyası və reaksiya şəraitinin qurulmasından və s.

Kəmiyyət metodlarının seçimi:

Kəmiyyət üsulları nisbi kəmiyyət üsullarına və mütləq kəmiyyət üsullarına bölünür.Müəyyən müalicə üsullarının gen ifadəsinə təsirini aşkar etmək, müxtəlif vaxtlarda gen ifadəsi fərqini aşkar etmək və müxtəlif toxumalarda gen ifadəsi fərqini müqayisə etmək üçün nisbi kəmiyyət təyini istifadə edilə bilər.Mütləq kəmiyyət təyini virusda nuklein turşusunun miqdarını və s.Təcrübələr apararkən, öz təcrübələrimizə uyğun olaraq uyğun kəmiyyət üsullarını seçməliyik.

Astar dizayn prinsipləri:

qPCR üçün primerin dizaynı birbaşa gücləndirmə səmərəliliyi və məhsulun spesifikliyi ilə bağlıdır.Buna görə də, yaxşı primerlərin düzgün dizaynı uğurlu qPCR-nin ilk addımıdır.Astarın dizaynında, adi astar dizaynı prinsipinə cavab verərkən aşağıdakı prinsiplərə diqqət yetirilməlidir:

1. Hədəf fraqmentinin uzunluğu 100 və 300 bp arasında idarə olunur;

2. Genomik DNT-nin təsirindən qaçmaq üçün çarpaz ekson dizaynı;

3. Layihələndirilmiş primerlər gücləndirmə effektivliyi üçün sınaqdan keçirilməlidir və yalnız gücləndirmə səmərəliliyi standarta çatdıqda (90-110%) kəmiyyət təcrübələri üçün istifadə edilə bilər;

4. Primer konsentrasiyası adətən 0,1uM və 1,0uM arasında optimallaşdırılır.

seçimiROX:

Kəmiyyət reaksiyası prosesində ROX nəticələrin təkrarlanmasını yaxşılaşdıraraq, buxarlanma və kondensasiya nəticəsində yaranan optik yol fərqini, pipetləmə xətasını və ya həcm fərqini bərabər şəkildə tənzimləyə bilər.Bununla belə, qeyd etmək lazımdır ki, ROX seçimi alətlə bağlıdır.qPCR aləti deşiklər arasındakı fərqi avtomatik düzəltmə funksiyasına malikdirsə, ona ROX əlavə etməyə ehtiyac yoxdur;əks halda ROX korreksiyasını əlavə etməlidir.Reagentlərin alınmasında kiçik tərəfdaşlar düzgün ROX seçmək üçün istifadə olunan alətə uyğun olmalıdır, sonradan səhvlərdən qaçın.

Reaksiya sisteminin hazırlanması:

20ul və 50ul reaksiya həcminə üstünlük verilir.Sistemi tərtib edərkən aşağıdakı məsələlərə diqqət yetirilməlidir:

1. Reaksiya sistemi son dərəcə təmiz iş dəzgahında ventilyasiya ilə hazırlanmalıdır, yeni ddH₂O hər bir təcrübə üçün istifadə olunur;

2. Hər bir təcrübə sistemdə çirklənmə olub-olmadığını yoxlamaq üçün NTC hazırlamalıdır və sistemi hazırlayarkən hər bir cüt primer NTC etməlidir;

3. RNT şablonunda gDNT qalığının olub-olmadığını aşkar etmək üçün aşkarlanma üçün hər bir nümunə üçün NRT hazırlana bilər;

4. Sistemi hazırlayarkən bir nümunə üçün ən azı 3 texniki təkrar etmək tövsiyə olunur;

5. Şablon cDNA olduqda, qPCR təcrübəsində əks transkripsiya sisteminin inhibə təsirini azaltmaq üçün 5-10 dəfə sulandırmaq tövsiyə olunur.Şablon kəmiyyətini gradient üzrə araşdırmaq daha yaxşıdır ki, CT dəyəri 20-30 arasında olsun;

6. Tələb olunan reaksiyaların sayını təyin edin, reaksiyaların sayı əsasında 5-10% artırın və həcm konfiqurasiya nömrəsini hesablayın;

7, sistem premiks prinsipi ilə hazırlanır, sentrifuqadan sonra qarışdırılır və qabarcıqların olmaması təmin edilir;

8, mümkün qədər dəstəkləyici istehlak materiallarını seçmək.

Əlaqədar RT-qPCR Kit