RNaz tez-tez RNT çıxarma təcrübələri aparan bir çox tələbənin eşitmək istəmədiyi həssas bir sözdür.Tamamilə silahlanmış, nəhayət yüksək zəhərli reagentlər olan fenol və xloroform ilə çıxarılan RNT deqradasiyaya uğradı.Mən barışmamışam!!!Bu gün gəlin məşhur Rnasenin mənşəyinə nəzər salaq.

Ribonuklease (RNase) və ya RNase, RNT-ni kiçik molekullara hidroliz edə bilən bir nukleazdır.RNase, kiçik molekullu bir protein olaraq, qeyri-adi sabitdir .Ənənəvi yüksək temperatur və yüksək təzyiqli buxar sterilizasiyası və protein inhibitorları onu tamamilə təsirsiz hala gətirə bilməz.RNase-nin sabitliyi əsasən strukturdakı disulfid bağlarından irəli gəlir.Məsələn, iribuynuzlu heyvanların mədəaltı vəzinin tez-tez istifadə edilən RNase-də cəmi 124 amin turşusu var, lakin 4 disulfid bağı var.Kükürd bağı və disulfid rabitəsi RNase-ə əla istilik sabitliyi verir.Bundan əlavə, rnase nisbətən kiçik molekulyar çəkiyə malikdir və bir çox hallarda orijinal konformasiyasını tez bərpa edə bilir.

Son dərəcə sabit olmaqla yanaşı,RNazlar laboratoriyada hər yerdə mövcuddur .RNaz bioloji müdafiə mexanizmidir.Bir hüceyrə üçün ekzogen RNT çox vaxt ölümcül olur.Ekzogen DNT ilə müqayisədə, ekzogen RNT çox vaxt daha təhlükəlidir.RNT məmnuniyyətlə transkripsiya edilir və tərcümə olunur, buna görə demək olar ki, bütün orqanizmlər ekzogen RNT-nin işğalından qorunmaq üçün RNazlar inkişaf etdirmişdir.Buna görə də, laboratoriyada yetişdirilən bakteriya hüceyrələri və RNT çıxaran siz RNaz aromasını yayır.İnsan bədən mayeləri (tüpürcək, göz yaşı və s.) çox miqdarda RNaz ehtiva edir, ona görə də RNT pozulduğunda ağlamayın.Nə qədər çox ağlayırsan, RNT deqradasiyası bir o qədər pis olur!!Bacı Daiyu RNT çıxarılması üçün uyğun deyil!

Bundan əlavə, zərif dəriniz də çoxlu RNase ehtiva edir və dəriyə toxunan markerlər, pipetlər, soyuducu qapıları və qapı tutacaqları da RNase ehtiva edir.

Bu qədər dolaşıqlıqla gəlin RNases ilə necə məşğul olacağımıza nəzər salaq.

RNT-ni çıxararkən hər kəsin ağlına gələn ilk şeydirDEPC(dietil pirokarbonat).DEPC əsasən RNase aktiv qrup histidinin imidazol halqası ilə birləşərək zülalı denatürasiya edir və bununla da fermentin fəaliyyətini maneə törədir.0,1% DEPC Rnase üzərində daha yaxşı xaricedici təsir göstərə bilər, lakin DEPC-nin məlum kanserogen olduğuna diqqət yetirməliyik, ona görə də istifadə edərkən xüsusi diqqət yetirilməlidir.

RNase üçün iki aspektdən başlamalıyıq,birincisi endogen RNaz-ın fəaliyyətini maneə törətməkdir

Trizolun tərkibində olan guanidin izotiyosiyanat və DTT kimi adi RNT ekstraksiya reagentləri RNase-nin disulfid bağını aça bilər, lakin hələ də bəzi RNazlar var, xüsusən də toxuma nümunələrində, ona görə də aşağı temperatura diqqət yetirin.

1.Toxuma nümunəsini çıxardıqdan sonra dərhal maye azotda və ya kommersiya RNT qoruyucu məhlulda batırın.

2.Hüceyrə nümunəsinin RNT-ni çıxardıqdan sonra onu lizis məhluluna əlavə edin və buz qutusunda lize edin.

3. Taşlama üçün maye azotdan istifadə etmək yaxşıdır toxuma nümunələri homojenləşdirildikdə.Maye azotu olmayan elektrik homojenizatordan istifadə edərkən, homojenat adapterinin tam əvvəlcədən soyudulmasına diqqət yetirin.

İkincisi ekzogen DNazdır

1.Tam silahlı olun, laboratoriya paltarı geyinin, maska ​​taxın və bir cüt yeni əlcək taxdığınızdan əmin olun (bu qədər qənaətcil olmayın! Qeyd etmək lazımdır ki, Trizol super aşındırıcıdır və əlcəklər vasitəsilə də çox güclüdür, ona görə də əllərinizə damcılamayın).

2.İstifadə olunmuş bütün pipet ucları, EP boruları, PCR boruları və digər avadanlıqlar de-RNase ilə müalicə edilməlidir.O, 0,1% DEPC-də isladılır və sonra yüksək təzyiq altında təzyiq altında saxlanıla bilər.Duman başlıqındakı əməliyyata diqqət yetirin.Yerli tiranlar fermentləri çıxarmaq üçün birbaşa istehlak materialları ala bilərlər.

P.S: Sizə tənbəl bir üsul deyim.Yüksək temperatur və yüksək təzyiq RNaz-ı tamamilə çıxara bilməsə də, onun böyük bir hissəsini çıxaracaq.2 dəfə yüksək temperatur və yüksək təzyiq yaxşı təsir göstərir, RNT-nin çıxarılması isə az təsir göstərir.

3.Alkoqol zülalları denatürasiya edə bilər,beləliklə, RNT çıxarılması cədvəli 75% spirtlə silinə bilər , və əlcəklər də spirtlə püskürtülə bilər.

4.Son RNT həlledici məhlul və sentrifuqa borusu da de-RNaz ilə müalicə edilməlidir.DEPC suyu çox istifadə edilən RNT həlledici məhluldur.Gəlin DEPC suyunun düzgün hazırlanma üsulundan danışaq (kommersiya DEPC alarkən onu yenidən qablaşdırmağı unutmayın)

DEPC-ni 1:1000 nisbətində ultratəmiz suya əlavə edin, yaxşı silkələyin, 37°C-də bir gecədə buraxın və yüksək temperatur və yüksək təzyiq altında 121°C-də 15 dəqiqə sterilizasiya edin.DEPC suyu -20°C temperaturda 1 ml alikvotlarda saxlanıla bilər.

Nəhayət, yekunlaşdırmaq üçün: aşağı temperatur əsasdır, istehlak materialları yaxşı idarə olunur, tam silahlı və daha az danışır!

Bəli, bu günün strategiyası üçün budur.Sizə qeyd etdiyiniz bütün RNT konsentrasiyası və saflığı arzulayıram.Hər iki A260/A280 2.0-dır!!!

Əlbəttə ki, əgər aotaq temperaturunda əməliyyat RNT çıxarılması dəsti, yuxarıdakı çətinliklərlə qarşılaşmaya bilərsiniz.

Otaq temperaturunda əməliyyat, DNaz əlavə etmədən, 11 dəqiqə ərzində hüceyrələrdən ümumi RNT çıxarır və 30 dəqiqə ərzində heyvan toxumalarından və ya bitkilərdən ümumi RNT çıxarır.

Sınaq nümunələri üçün əlaqə saxlayın:overseas@foregene.com

Əlaqədar məhsullar:

https://www.foreivd.com/cell-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/animal-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/plant-total-rna/