Ənənəvi tərs transkriptazalar yüksək temperaturlara dözə bilmirlər (MMLV aktivliyi üçün optimal temperatur 37-50°C, AMV isə 42-60°C-dir).Daha mürəkkəb viral RNT aşağı temperaturda cDNA-ya effektiv şəkildə əks transkripsiya edilə bilməz, nəticədə aşkarlama effektivliyi azalır.Ənənəvi RT-qPCR ümumiyyətlə iki əsas fermentin (əks transkriptaza və DNT polimeraza) iştirakını tələb edir, bu da reaksiya sisteminin işini sadələşdirməyi və xərcləri azaltmağı qeyri-mümkün edir.Burada iki yüksək temperatura davamlı tərs transkriptazı, TtH və RevTaq təqdim edəcəyik.Bu iki ferment də DNT polimeraz funksiyasına malikdir, ona görə də onlara bifunksional fermentlər deyilir.

TtH DNT polimeraza

Siz termofil Thermus thermophilus HB8 bakteriyasından əldə edilən TtH haqqında eşitmisiniz.Mg2+ kimi ikivalent kationların iştirakı ilə DNT polimeraza aktivliyinə malikdir.Taq fermenti kimi PCR reaksiyalarında geniş istifadə olunur, lakin Taq fermentindən daha yüksək istilik müqavimətinə malikdir, buna görə də yüksək GC məzmun şablonları ilə PCR-də daha yaxşı təsir göstərir.

· Bu fermentin əsasən 3′→5′ eksonukleaza aktivliyi və 5′→3′ ekzonukleaz aktivliyi yoxdur, ona görə də onu dideoksi ardıcıllığı üçün istifadə etmək olar.

· Bu ferment RTase aktivliyinə malikdir.Mn2+ olduqda RTase aktivliyi artacaq.Bu xüsusiyyətdən istifadə edərək, eyni boruda, yəni bir addımlı RT-PCR-də əks transkripsiya reaksiyası və PCR reaksiyasını yerinə yetirmək üçün istifadə edilə bilər.Lakin Mn2+ olduqda RT-PZR-in dəqiqliyi yüksək deyil.RT fəaliyyətinin rnaase H fəaliyyəti ilə heç bir əlaqəsi yoxdur.

· Tth-DNT polimerazının artan aktivliyi (pH9, optimal +55℃～+70℃, maksimum +95℃) RNT-nin ikincil strukturunun yaratdığı problemləri aradan qaldırır.Nəticədə cDNT Mg2+ ionlarının iştirakı ilə eyni fermentlə PCR ilə gücləndirilə bilər.

· Tth-DNT polimerazanın yüksək temperaturda əks transkripsiya və DNT gücləndirilməsini yerinə yetirmək qabiliyyəti bu fermenti kəmiyyət RT-PZR, klonlaşdırma və hüceyrə və virus RNT-nin gen ifadə analizi üçün faydalı edir.
· Tth-DNT polimeraza RNT-ni 1kb-ə qədər gücləndirmək üçün RT-PCR üçün istifadə olunur.

Xüsusiyyətlər və üstünlüklər

T-ci DNT polimeraza:

• Optimallaşdırılmış polimeraza zəncirvari reaksiya (PZR) məhsul ölçüsünü, RT-PZR reaksiyasında ən azı 1000 bp təmin edin

• Dəyişdirilmiş deoksiribonukleozid trifosfatı substrat kimi qəbul edin

• RNase H aktivliyi ilə əlaqəli deyil

• Adətən RNT-də mövcud olan yüksək ikinci dərəcəli strukturla əlaqəli problemləri aradan qaldırmaq üçün yüksək istilik sabitliyinə malikdir

RevTaq RT-PCR DNT polimeraza

Ters transkriptaza aktivliyi olan istiliyədavamlı DNT polimeraza

RevTaq-RT-PCR-DNT polimeraza istiqamətləndirilmiş və süni təkamül yolu ilə əldə edilmiş əks transkriptaza və DNT polimeraza fəaliyyətlərinə malik mühəndislik üsulu ilə hazırlanmış, yüksək istiliyədavamlı, iki funksiyalı fermentdir.

· 95°C-də RevTaq RT-PCR DNT polimerazının yarımxaricolma dövrü 40 dəqiqədən çoxdur.

· RevTaq RT-PCR DNT polimerazı RNT şablonundan birbaşa yüksək temperaturda əks transkripsiyaya imkan verir və əks transkripsiya addımı daha çox cDNA şablonu yaratmaq üçün bir neçə dəfə təkrarlana bilər.

· RevTaq RT-PCR DNT polimerazı “sıfır pilləli” RT-PCR (izotermik tərs transkripsiya addımı yoxdur) imkan verir, çünki siklik PCR genişləndirmə addımında əks transkripsiya və DNT gücləndirilməsi eyni vaxtda baş verir.Bu, həmçinin yüksək temperaturda əks transkripsiya reaksiyasını təşviq edir və bununla da yüksək temperaturda RNT-də güclü ikincil strukturun əriməsi zamanı yaranan problemləri minimuma endirir.

· Aptamer əsaslı isti başlanğıc formuluna görə, RevTaq RT-PCR DNT polimerazı yumşalma və uzatma temperaturu 57°C-dən yüksək olduqda daha yaxşı nəticələr verəcəkdir.

· Ferment istiliyə davamlı olduğundan, çox yüksək ərimə nöqtələri (>60°C) olan primerlərin və zondların layihələndirilməsi tövsiyə olunur.

· Reaksiya quraşdırma prosesi zamanı temperatur qradiyenti vasitəsilə qızdırma/uzatma pilləsinin temperaturunu optimallaşdırmaq tövsiyə olunur.

· Temperatur nə qədər yüksək olarsa, PCR-in spesifikliyi bir o qədər yüksək olar.Əks transkripsiya dövrü adətən PCR dövründən daha yüksək temperaturda həyata keçirilir, çünki DNT Primer:RNA Template hibridizasiyası adətən DNT Primer:cDNA Template duplexindən daha yüksək ərimə nöqtəsinə malikdir.

· RevTaq RT-PCR DNT polimerazı genetik olaraq hazırlanmış və optimallaşdırılmışdır və amplikonun ölçüsü 60-300 bp arasındadır.

RevTaq RT-PCR DNT polimeraza aşkarlama həddi 4 nüsxəyə çatır/

Optimallaşdırılmış reaksiya sistemi (yüksək ərimə nöqtəsi olan primerlərin qurulması) şəkildə göstərilmişdir.RevTaq RT-PCR DNT polimerazı ilə idarə olunan RT-PCR, TaqPath 1-addımlı RT-qPCR master mixindən daha yaxşı həssaslıq və daha aşağı aşkarlama Nümunə seyreltmə qradiyenti göstərir.

Daha çox üstünlüklər:

Tez başlanğıc funksiyası → İlkin termal denatürasiya addımı atlana bilər.

İsti başlanğıc aptamer formulu → Dərhal 100% ferment aktivliyini təmin edin və aşağı temperaturda (<57°C) qeyri-spesifik gücləndirmənin qarşısını alın.

Parçalanma funksiyası → RNT çıxarılması mərhələsi buraxılıb, çünki RevTaq RT-PCR DNT polimerazı həm də xam reaksiya nümunələrini emal edə bilir.O, eukariotların, bakteriyaların və virusların hüceyrə membranlarını isti RT-PZR dövründə dərhal məhv edə bilər.

IVD xammal səviyyəsi → yüksək keyfiyyət standartları və son dərəcə rəqabətli qiymətlər