Yapışqan bərpasını yaxşılaşdırmaq üçün məsləhətlər

1. Elektroforez zamanı nümunə yükünü artırın.

2. Təzə hazırlanmış elektroforez tamponundan istifadə edin.

3. Yapışqan kəsərkən, yapışqanın kəsilməsinin həcmini azaltmaq üçün yalnız yapışqanı zolaqlarla kəsməyə çalışın: bir neçə məqsədli fraqmentli yapışqan lazım deyil, əks halda bu, bərpa sürətinə təsir edəcək.

4. İki və ya daha çox yapışqan parçasını əritdikdən sonra, həcminin nə qədər böyük olmasından asılı olmayaraq bir boru istifadə edin və eyni sütuna köçürün.

5. Solda əlavə edilən məhlul bir az daha çox ola bilər ki, bu da DNT-nin membrana bağlanması üçün daha əlverişlidir, lakin ümumiyyətlə 750ul-dən çox deyil.

6. Gelin bərpası üçün əsas sütundakı məhlulun duz konsentrasiyası, turşuluğu (yük) və hidrofobikliyi vasitəsilə DNT-ni sütuna bağlamaqdır.Buna görə də, əgər elektroforez tamponunun pH çox yüksək olarsa, 10ul (pH 5.0, 3mol/L NaAC) məhlula əlavə edilə bilər;membranda DNT molekullarını daha yaxşı tutmaq üçün yapışqan həll edildikdən sonra mayeyə qızdırmaq üçün 30% izopropanol əlavə edilə bilər.

7. Eluent əlavə etməzdən əvvəl etanolun tam buxarlanması üçün sütunu otaq temperaturunda bir neçə dəqiqə (təxminən 10 dəqiqə) buraxın.

8. Nəhayət, bərpa həcmini minimuma endirmək üçün daha az eluent əlavə edin.Ümumiyyətlə, elüsyon üçün 30-50μl eluent istifadə olunur (çox az deyil, əks halda membranı nəmləndirə bilməyəcək, bu da elüsyon üçün əlverişli deyil);membrana bağlanmış DNT-ni tam elüt etmək üçün elüsyon damcıları membranın mərkəzindədir.

9. Elüent əlavə edildikdən sonra onu 55 dərəcə su banyosunda 5 dəqiqə elüt etmək və ya 50 dərəcə su banyosuna 10 dəqiqədən çox qoymaq və ya bir gecədə 4 dərəcə istilikdə parafilm ilə bağlamaq, sonra ertəsi gün bərpa etmək üçün sentrifuqa etmək olar, təsir yaxşıdır.

10. Santrifüj edilmiş eluatı yenidən adsorbsiya sütununa əlavə edin və yenidən sentrifuqa edin.

PCR məhsulunun bərpası üçün ətraflı metodlar və prosedurlar

1. Adi rezin təkrar emalı

Yapışqanı bərpa etmək istəyirsinizsə, rahat və bir qədər yüksək bərpa dərəcəsi olan bir dəstdən istifadə etmək yaxşıdır.Əgər həqiqətən onu əl ilə bərpa etmək lazımdırsa, yapışqanın kəsilməsindən sonra TE həcminin 3 qatını əlavə edə bilərsiniz.Su banyosunda əridikdən sonra fenol, fenol/xloroform təmiz çıxarılır və etanol çökdürülür.Bu belədir.

2. Aşağı ərimə nöqtəli gellərdən DNT-nin bərpası

DNT fraqmentlərinin təmizlənməsi Gelin həcminə bərabər olan TE (10 mmol/l Tris-HCl pH8,0, 0,1 mmol/l EDTA) əlavə edin və geli tamamilə həll etmək üçün 5 dəqiqə 65°C su banyosuna qoyun.

Otaq temperaturuna gətirildikdən sonra bərabər miqdarda fenol (TE ilə doymuş, TE yuxarı təbəqədə möhürlənmiş, fenolun aşağı təbəqəsi çıxarılmışdır) əlavə edilmiş və qarışıq yumşaq qarışdırılmışdır (qarışdırmağa ehtiyac yoxdur) və 12000 rpm-də 3 dəqiqə sentrifuqa edilmişdir.1-2 dəfə təkrarlayın.

Supernatantı götürün, etanol çöküntüsünü həyata keçirmək üçün 0,1 həcmdə 3mol/L natrium asetat (pH 5,2) və 2,5 dəfə mütləq etanol əlavə edin.Təmizlənmiş DNT-ni müvafiq miqdarda TE ilə həll edin, məzmunu ölçün və istifadəyə hazırlayın (hədəf gen strukturunun təhlili, zond hazırlanması və s. üçün istifadə oluna bilər).

3. Yaxşı gücləndirmə spesifikliyi ilə PCR bərpası

PCR gücləndirilməsinin spesifikliyi yaxşıdırsa, bu, sadəcə olaraq, PCR məhsulunun sadə bir təmizlənməsi və bərpasıdır.Siz PCR məhsuluna 50ug/ml proteinaz K əlavə edə bilərsiniz, 1 saat ərzində 37 dərəcə, bir dəfə fenol/xloroform ilə ekstraksiya, bir dəfə xloroform ilə ekstraksiya və 0,1 həcmdə supernatant əlavə edə bilərsiniz.Natrium asetat 2,5 həcmdə mütləq etanol ilə çökdürülməklə əldə edilmişdir.

Əlaqədar məhsullar:

https://www.foreivd.com/pcr-purification-kit-2-product/

https://www.foreivd.com/blood-superdirecttm-pcr-kit-edta-product/