1. Əsas biliklər (eksperimental hissəni görmək istəyirsinizsə, birbaşa ikinci hissəyə keçin)
Ənənəvi PCR-in törəmə reaksiyası olaraq, Real Time PCR əsasən flüoresan siqnalının dəyişməsi vasitəsilə real vaxtda PCR gücləndirmə reaksiyasının hər bir dövründə gücləndirmə məhsulunun miqdarının dəyişməsini izləyir və ct dəyəri ilə standart əyri arasındakı əlaqə vasitəsilə başlanğıc şablonunu kəmiyyətcə təhlil edir.
RT-PCR-nin xüsusi məlumatları bunlardırəsas, flüoresan həddivəCt dəyəri.
| əsas: | 3-15-ci dövrün flüoresan dəyəri ölçmənin təsadüfi səhvindən qaynaqlanan əsas (əsas xətt) dir. |
| Həddi (həddi): | Gücləndirmə əyrisinin eksponensial artım bölgəsində müvafiq mövqedə təyin edilmiş flüoresans aşkarlama limitinə istinad edir, ümumiyyətlə, baza xəttinin standart yayınmasından 10 dəfə çoxdur. |
| CT dəyəri: | Bu, hər bir reaksiya borusunda flüoresans dəyəri eşik həddinə çatdıqda PCR dövrlərinin sayıdır. Ct dəyəri ilkin şablonun miqdarı ilə tərs mütənasibdir. |
RT-PCR üçün ümumi etiketləmə üsulları:
| üsul | üstünlük | çatışmazlıq | tətbiq dairəsi |
| SYBR GreenⅠ | Geniş tətbiq, həssas, ucuz və rahatdır | Astar tələbləri yüksəkdir, qeyri-spesifik bantlara meyllidir | Müxtəlif hədəf genlərin kəmiyyət təhlili, gen ifadəsi üzrə tədqiqatlar və transgen rekombinant heyvanlar və bitkilər üzərində tədqiqatlar üçün uyğundur. |
| TaqMan | Yaxşı spesifiklik və yüksək təkrarlanma qabiliyyəti | Qiymət yüksəkdir və yalnız konkret məqsədlər üçün uyğundur. | Patogenin aşkarlanması, dərmana davamlılıq geninin tədqiqi, dərmanın effektivliyinin qiymətləndirilməsi, genetik xəstəliklərin diaqnostikası. |
| molekulyar mayak | Yüksək spesifiklik, flüoresan, aşağı fon | Qiyməti bahadır, yalnız konkret məqsəd üçün uyğundur, dizaynı çətindir, qiyməti də bahadır. | Xüsusi gen analizi, SNP analizi |
2. Eksperimental addımlar
2.1 Eksperimental qruplaşma haqqında- qrupda çoxlu quyu olmalıdır və bioloji təkrarlar olmalıdır.
| ① | Boş nəzarət | Təcrübələrdə hüceyrə artım vəziyyətini aşkar etmək üçün istifadə olunur |
| ② | Mənfi nəzarət siRNA (qeyri-spesifik siRNA ardıcıllığı) | RNT hərəkətinin spesifikliyini nümayiş etdirin.siRNA 200nM konsentrasiyasında qeyri-spesifik stress reaksiyasına səbəb ola bilər. |
| ③ | Transfeksiya Reagentinə Nəzarət | Transfeksiya reagentinin hüceyrələrə toksikliyini və ya hədəf genin ifadəsinə təsirini istisna edin |
| ④ | siRNA hədəf genə qarşı | Hədəf genin ifadəsini yıxın |
| ⑤ (isteğe bağlı) | müsbət siRNA | Eksperimental sistem və əməliyyat problemlərini həll etmək üçün istifadə olunur |
| ⑥ (isteğe bağlı) | Floresan nəzarət siRNA | Hüceyrə transfeksiyasının effektivliyi mikroskopla müşahidə edilə bilər |
2.2 Astar dizaynının prinsipləri
| Gücləndirilmiş fraqment ölçüsü | Tercihen 100-150bp |
| Astar uzunluğu | 18-25bp |
| GC məzmunu | 30%-70%, tercihen 45%-55% |
| Tm dəyəri | 58-60 ℃ |
| Ardıcıllıq | Davamlı T/C-dən çəkinin;A/G davamlı |
| 3 son ardıcıllıq | GC zəngin və ya AT zəngindən çəkinin;terminal bazası tercihen G və ya C-dir;T-dən qaçmaq daha yaxşıdır |
| Tamamlayıcılıq | Primer daxilində və ya iki primer arasında 3-dən çox əsasdan ibarət tamamlayıcı ardıcıllıqlardan çəkinin |
| Spesifiklik | Primer spesifikliyini təsdiqləmək üçün partlayış axtarışından istifadə edin |
①SiRNA növə xasdır və müxtəlif növlərin ardıcıllığı fərqli olacaq.
②SiRNA dondurulmuş qurudulmuş tozda qablaşdırılır, otaq temperaturunda 2-4 həftə stabil saxlanıla bilər.
2.3 Əvvəlcədən hazırlanmalı olan alətlər və ya reagentlər
| Astar (daxili istinad) | İrəli və geri iki daxil olmaqla |
| Primerlər (hədəf gen) | İrəli və geri iki daxil olmaqla |
| Hədəf Si RNT (3 zolaq) | Ümumiyyətlə, şirkət 3 zolağı sintez edəcək və sonra RT-PCR ilə üçündən birini seçəcək. |
| Transfeksiya dəsti | Lipo2000 və s. |
| RNT Sürətli Ekstraksiya Kiti | Transfeksiyadan sonra RNT çıxarılması üçün |
| Sürətli tərs transkripsiya dəsti | cDNT sintezi üçün |
| PCR gücləndirmə dəsti | 2×Super SYBR Yaşıl qPCR Master Mix |
2.4 Xüsusi eksperimental addımlarda diqqət yetirilməli olan məsələlərlə bağlı:
①siRNA transfeksiya prosesi
1. Kaplama üçün siz 24 quyu, 12 quyu və ya 6 quyu boşqabını seçə bilərsiniz (24 quyu boşqabının hər bir quyusunda təklif olunan orta RNT konsentrasiyası təqribən 100-300 ng/uL-dir) və hüceyrələrin optimal transfeksiya sıxlığı 60%-80%-ə qədərdir.
2. Transfeksiya mərhələləri və xüsusi tələblər təlimatlara ciddi şəkildə uyğundur.
3. Transfeksiyadan sonra nümunələr mRNT aşkarlanması (RT-PCR) və ya 48-96 saat ərzində zülal aşkarlanması (WB) üçün 24-72 saat ərzində toplana bilər.
② RNT çıxarılması prosesi
1. Ekzogen fermentlərlə çirklənmənin qarşısını alın.Buraya əsasən ciddi şəkildə maskalar və əlcəklər taxmaq daxildir;sterilizasiya edilmiş pipet uclarından və EP borularından istifadə etməklə;təcrübədə istifadə olunan su RNazsız olmalıdır.
2. Təmizliyi və məhsuldarlığı həqiqətən yaxşılaşdıracaq sürətli çıxarış dəstində təklif olunan kimi iki dəfə etmək tövsiyə olunur.
3. Tullantı maye RNT sütununa toxunmamalıdır.
③ RNT kəmiyyəti
RNT çıxarıldıqdan sonra onu birbaşa Nanodrop ilə ölçmək olar və minimum göstərici 10ng/ul kimi aşağı ola bilər.
④Tərs transkripsiya prosesi
1. RT-qPCR-nin yüksək həssaslığına görə, sonrakı Ct-nin çox fərqli olmasının və ya SD-nin statistik təhlil üçün çox böyük olmasının qarşısını almaq üçün hər bir nümunə üçün ən azı 3 paralel quyu hazırlanmalıdır.
2. Master mixi dəfələrlə dondurmayın və əritməyin.
3. Hər bir boru/deşik yeni uc ilə əvəz edilməlidir!Nümunələr əlavə etmək üçün davamlı olaraq eyni pipet ucundan istifadə etməyin!
4. Nümunə əlavə edildikdən sonra 96 quyu boşqabına yapışdırılmış plyonka boşqab ilə hamarlanmalıdır.Borunun divarındakı mayenin aşağı axması və hava qabarcıqlarını çıxarması üçün onu maşına qoymazdan əvvəl sentrifuqa etmək yaxşıdır.
⑤Ümumi əyri analizi
| Loqarifmik artım dövrü yoxdur | Şablonun yüksək konsentrasiyası ola bilər |
| CT dəyəri yoxdur | Floresan siqnallarının aşkarlanması üçün səhv addımlar; primerlərin və ya zondların deqradasiyası – onun bütövlüyü PAGE elektroforezi ilə aşkar edilə bilər; şablonun qeyri-kafi miqdarı; şablonların deqradasiyası – nümunənin hazırlanmasında çirklərin daxil olmasının və təkrar dondurulmasının və əriməsinin qarşısını almaq; |
| Ct>38 | Aşağı gücləndirmə səmərəliliyi;PCR məhsulu çox uzundur;müxtəlif reaksiya komponentləri pozulur |
| Xətti gücləndirmə əyrisi | Zondlar təkrar donma-ərimə dövrləri və ya uzun müddət işığa məruz qalma ilə qismən deqradasiya edilə bilər. |
| Dublikat deşiklərdəki fərq xüsusilə böyükdür | Reaksiya məhlulu tam əridilmir və ya reaksiya məhlulu qarışdırılmır;PCR alətinin termal vannası flüoresan maddələrlə çirklənmişdir |
2.5 Məlumatların təhlili haqqında
qPCR-nin məlumat təhlili nisbi kəmiyyət və mütləq kəmiyyətə bölünə bilər.Məsələn, müalicə qrupundakı hüceyrələr nəzarət qrupundakı hüceyrələrlə müqayisədə,
X geninin mRNT-si neçə dəfə dəyişir, bu nisbi kəmiyyətdir;müəyyən sayda hüceyrədə X geninin mRNT-si
Nə qədər nüsxə var, bu mütləq kəmiyyətdir.Adətən laboratoriyada ən çox istifadə etdiyimiz nisbi kəmiyyət metodudur.Adətən,2-ΔΔct metodutəcrübələrdə ən çox istifadə olunur, ona görə də burada yalnız bu üsul ətraflı şəkildə təqdim ediləcək.
2-ΔΔct metodu: Əldə edilən nəticə eksperimental qrupdakı hədəf genin nəzarət qrupundakı hədəf genin ifadəsindəki fərqdir.Həm hədəf genin, həm də daxili istinad geninin gücləndirmə effektivliyinin 100%-ə yaxın olması, nisbi sapmanın isə 5%-dən çox olmaması tələb olunur.
Hesablama üsulu aşağıdakı kimidir:
Δct nəzarət qrupu = nəzarət qrupunda hədəf genin ct dəyəri – nəzarət qrupunda daxili istinad geninin ct dəyəri
Δct eksperimental qrup = eksperimental qrupda hədəf genin ct dəyəri – eksperimental qrupda daxili istinad geninin ct dəyəri
ΔΔct=Δct eksperimental qrup-Δct nəzarət qrupu
Nəhayət, ifadə səviyyəsindəki fərqin qatını hesablayın:
Fold = 2-ΔΔct dəyişdirin (excel funksiyasına uyğundur POWER)
Əlaqədar məhsullar:
Göndərmə vaxtı: 20 may 2023-cü il
