Ⅰ. Reaksiya sisteminin həssaslığını artırın:
1. Yüksək keyfiyyətli RNT-ni ayırın:
Uğurlu cDNT sintezi yüksək keyfiyyətli RNT-dən gəlir.Yüksək keyfiyyətli RNT ən azı ümumi daha uzun müddət təmin etməlidir və EDTA və ya SDS kimi qeyd fermentləri olmayan inhibitorları ehtiva etməməlidir.RNT keyfiyyəti cDNA-ya köçürə biləcəyiniz ardıcıllıq məlumatının maksimum dəyərini müəyyən edir.Ümumi RNT təmizləmə üsulu izosiyanat/asidofenoldan istifadənin mərhələli üsuludur.RNaz-ın çirklənməsinin qarşısını almaq üçün RNaz ilə zəngin bir nümunədən (məsələn, mədəaltı vəzi) ayrılan RNT yüksək keyfiyyətli RNT-ni saxlamaq üçün formaldehidin saxlanmasını tələb edir ki, bu da uzunmüddətli saxlama üçün daha çox tələb olunur.Siçovul qaraciyərindən çıxarılan RNT suda bir həftə saxlandıqdan sonra əsasən parçalandı, siçovul dalağından çıxarılan RNT isə üç il suda saxlandıqdan sonra sabit qaldı.Bundan əlavə, 4kb-dən böyük transkriptlər kiçik transkriptlərə nisbətən RNaz deqradasiyasının izlərinə daha həssasdır.Saxlama RNT nümunəsinin sabitliyini artırmaq üçün RNT ionlu bir metalmamində həll edilə bilər və -70 ° C-də saxlanılır.RNT-ni saxlamaq üçün istifadə edilən thylide tərkibində RNT-ni parçalayan müxtəlif obyekt olmamalıdır.Mədəaltı vəzidən əldə edilən RNT ən azı bir il metalmamində saxlanıla bilər.RNT-dən istifadə etməyə hazır olduqda, RNT-ni çökdürmək üçün aşağıdakı üsullardan istifadə edə bilərsiniz: 0,2 m və 4 dəfə etanol həcminə NaCl əlavə edin, otaq temperaturunda 3-5 dəqiqə və 10,000 × g mərkəzdənqaçma ilə 5 dəqiqə qoyun.
2. RNaseH aktivliyi olmayan tərs transkriptazadan istifadə edin (RNaseH-):
RNaz inhibitorları cDNT sintezinin uzunluğunu və məhsuldarlığını artırmaq üçün tez-tez tərs transkripsiya reaksiyalarına əlavə edilir.RNaz inhibitoru ilk zəncirvari sintez reaksiyasına DTT kimi tamponların və reduksiyaedicilərin iştirakı ilə əlavə edilir, çünki cDNT-dən əvvəlki sintez prosesi inhibitoru denatürasiya edir və bununla da RNT-ni parçalayan bağlı RNazları buraxır.Protein RNase inhibitoru yalnız RNaz A, B, C tərəfindən RNT-nin parçalanmasının qarşısını alır və dəridə RNazların qarşısını almır, buna görə də bu inhibitorların istifadəsinə baxmayaraq, RNazların barmaqlardan daxil edilməməsinə diqqət yetirilməlidir.
Əks transkriptaza RNT-nin cDNT-yə çevrilməsini katalizləyir.Həm M-MLV, həm də AMV öz polimeraz fəaliyyətinə əlavə olaraq endogen RNaseH aktivliyinə malikdir.RNaseH aktivliyi RNT şablonları və DNT primerləri və ya cDNT uzatma zəncirləri arasında əmələ gələn heterozigot zəncirlər üçün polimeraza fəaliyyəti ilə rəqabət aparır və RNT-ni: DNT komplekslərindəki RNT zəncirlərini deqradasiya edir.RNaseH aktivliyi ilə deqradasiyaya uğramış RNT şablonları cDNA sintezinin məhsuldarlığını və uzunluğunu azaltmaqla cDNA sintezi üçün effektiv substrat kimi artıq istifadə edilə bilməz.Beləliklə, əks transkriptazın RNaseH aktivliyini aradan qaldırmaq və ya əhəmiyyətli dərəcədə azaltmaq böyük fayda verəcəkdir.
SuperScriptⅡ tərs transkriptaza, RNaseH-nin MMLV tərs transkriptazası və termoScript tərs transkriptaza, RNaseH-nin AMV-si MMLV və AMV-dən daha çox tam uzunluqlu cDNA verdi.RT-PCR həssaslığı sintez edilən cDNA miqdarından təsirlənir.ThermoScript AMV-dən daha həssasdır.RT-PCR məhsullarının ölçüsü tərs transkriptazın cDNA-nı sintez etmək qabiliyyəti ilə məhdudlaşır, xüsusən daha böyük Cdna-ların klonlanması zamanı.MMLV ilə müqayisədə SuperScripⅡ uzun RT-PCR məhsullarının məhsuldarlığını əhəmiyyətli dərəcədə artırdı.RNaseH-nin tərs transkriptazı da istilik dayanıqlığını artırır, buna görə də reaksiya normaldan 37-42 ° C-dən yüksək temperaturda aparıla bilər.Təklif olunan sintez şərtləri altında oliqo(dT) primerləri və 10μCi [alfa-p]dCTP istifadə edilmişdir.Birinci zəncirin ümumi hasilatı TCA yağıntı üsulu ilə hesablanmışdır.Tam uzunluqlu cDNT ölçüyə görə çeşidlənmiş zolağın çıxarılması və qələvi agaroza geldə sayılması ilə təhlil edilmişdir.
3. Əks transkripsiyanın istilik qorunması temperaturunu artırın:
Daha yüksək saxlama temperaturu RNT-nin ikincil strukturunu açmağa və reaksiyanın məhsuldarlığını artırmağa kömək edir.Əksər RNT şablonları üçün RNT və primeri tampon və ya duz olmadan 65°C-də saxlamaq və sonra onları buz üzərində tez soyutmaq əksər ikinci dərəcəli strukturları aradan qaldırır və primerlərin bağlanmasına imkan verir.Bununla belə, bəzi şablonlar hələ də istilik denaturasiyasından sonra da ikinci dərəcəli quruluşa malikdir.Bu çətin şablonların gücləndirilməsi ThermoScript əks transkriptazadan istifadə etməklə və gücləndirməni yaxşılaşdırmaq üçün əks transkriptaza reaksiyasını daha yüksək temperaturda yerləşdirməklə həyata keçirilə bilər.Xüsusilə cDNT sintezi gen-spesifik primerlərdən (GSPS) istifadə edilərkən daha yüksək saxlama temperaturları da spesifikliyi artıra bilər (bax. Fəsil 3).GSP istifadə edirsinizsə, primerin Tm dəyərinin gözlənilən saxlama temperaturu ilə eyni olduğundan əmin olun.60 ℃-dən yuxarı oliqo(dT) və təsadüfi primerlərdən istifadə etməyin.Təsadüfi primerlər 60 ° C-ə yüksəlməzdən əvvəl 10 dəqiqə 25 ° C-də saxlanılmalıdır.Daha yüksək tərs transkripsiya temperaturlarından istifadə etməklə yanaşı, spesifikliyi RNT/primer qarışığını 65℃ denaturasiya temperaturundan tərs transkripsiya saxlama temperaturuna birbaşa köçürməklə və əvvəlcədən qızdırılmış 2× reaksiya qarışığını (cDNA termal başlanğıc sintezi) əlavə etməklə artırmaq olar.Bu yanaşma daha aşağı temperaturda baş verən molekullararası baza cütləşməsinin qarşısını almağa kömək edir.PCR alətindən istifadə RT-PCR üçün tələb olunan çoxlu temperatur açarlarını asanlaşdırır.
T-ci istiliklə stabilləşdirilmiş polimeraza Mg2+ və Mn2+ varlığında RNT polimerazın iştirakı ilə DNT polimeraza kimi çıxış edir.65 ° C-ə qədər istilik saxlaya bilir.Bununla belə, PCR zamanı Mn2+ mövcudluğu sədaqəti azaldır, bu da Tth polimerazı cDNA klonlaması kimi yüksək dəqiqlikli gücləndirmə üçün daha az uyğun edir.Bundan əlavə, Tth əks transkripsiyada daha az effektivdir, bu da həssaslığı azaldır və tək bir ferment əks transkripsiya və PCR həyata keçirə bildiyindən, cDNT-nin gücləndirilmiş məhsullarını çirklənmiş genomik DNT-dən ayırmaq üçün əks transkripsiya olmadan nəzarət reaksiyalarından istifadə edilə bilməz.
4. Əks transkripsiyanı təşviq edən əlavə:
Birinci zəncirvari sintez reaksiyasına qliserin və DMSO daxil olmaqla aşqarların əlavə edilməsi nuklein turşusunun ikiqat zəncirinin dayanıqlığını azalda bilər və RNT ikincili strukturunu açır.SuperScriptⅡ və ya MMLV fəaliyyətinə təsir etmədən 20%-ə qədər qliserin və ya 10%-ə qədər DMSO əlavə edilə bilər.AMV həmçinin aktivliyi azaltmadan 20%-ə qədər qliserola dözə bilir.SuperScriptⅡ tərs transkripsiya reaksiyasında RT-PCR həssaslığını artırmaq üçün 10% qliserol əlavə etmək və 45℃ temperaturda izolyasiya etmək olar.PZR-ə retrotranskripsiya-reaksiya məhsulunun 1/10 hissəsi əlavə olunarsa, gücləndirmə reaksiyasında qliserolun konsentrasiyası 0,4% təşkil edir ki, bu da PZR-nin qarşısını almaq üçün kifayət deyil.
5. RNaseH emalı:
Həssaslıq PCR-dən əvvəl cDNT sintez reaksiyalarını RNaseH ilə müalicə etməklə yaxşılaşdırıla bilər.Bəzi şablonlar üçün cDNA sintez reaksiyasındakı RNT-nin gücləndirilmiş məhsulların bağlanmasının qarşısını aldığı düşünülür, bu halda RNaseH müalicəsi həssaslığı artıra bilər.Ümumiyyətlə, RNaseH müalicəsi nisbətən uzun tam uzunluqlu cDNA hədəf şablonunun gücləndirilməsi üçün tələb olunur, məsələn, aşağı nüsxə ilə vərəmli skerozⅡ.Bu çətin şablon üçün RNaseH SuperScriptⅡ və ya AMV tərəfindən sintez edilən cDNA tərəfindən yaradılan siqnalı gücləndirdi.Əksər RT-PZR reaksiyaları üçün RNaseH müalicəsi isteğe bağlıdır, çünki 95 ℃ izolyasiya edilmiş PCR denaturasiya mərhələsi adətən RNT: DNT kompleksindən RNT-ni hidroliz edir.
6. Az miqdarda RNT-nin aşkarlanması üçün təkmilləşdirilmiş üsullar:
Yalnız kiçik miqdarda RNT mövcud olduqda RT-PZR xüsusilə çətin olur.RNT-nin ayrılması zamanı daşıyıcı kimi glikogenin əlavə edilməsi kiçik nümunələrin məhsuldarlığını artırmağa kömək edir.Trizol ilə eyni vaxtda RNazsız glikogen əlavə edilə bilər.Glikogen suda həll olunur və sonrakı yağışa kömək etmək üçün RNT ilə su fazasında qala bilər.RNazsız glikogenin tövsiyə olunan konsentrasiyası 50 mq toxuma və ya 106 kultura hüceyrədən az olan nümunələr üçün 250μg/ml təşkil edir.
SuperScriptⅡ istifadə edərək əks transkripsiya reaksiyaları üçün asetilləşdirilmiş BSA-nın əlavə edilməsi həssaslığı artıra bilər və kiçik miqdarda RNT üçün SuperScriptⅡ miqdarının azaldılması və 40 vahid RnaseOut nukleaza inhibitorunun əlavə edilməsi aşkarlanma səviyyəsini yaxşılaşdıra bilər.RNT ayrılması zamanı qlikogen istifadə edilərsə, SuperScriptⅡ istifadə edərək əks transkripsiya reaksiyaları üçün BSA və ya RNase inhibitorlarının əlavə edilməsi hələ də tövsiyə olunur.
Ⅱ. RT-PCR-nin spesifikliyini artırın
1. cNDA sintezi:
Birinci zəncir cDNT sintezini başlatmaq üçün üç müxtəlif üsuldan istifadə edilə bilər və hər bir metodun nisbi spesifikliyi sintez edilən cDNA-nın miqdarına və növünə təsir göstərir.
Təsadüfi primer metodu üç üsuldan ən az spesifikdir.Qısa, qismən uzunluqlu cDNA istehsal etmək üçün primerlər transkript boyu bir çox yerdə tavlanır.Bu üsul tez-tez ikincili struktur bölgələri olan və ya əks transkriptazın təkrarlana bilməyən son nöqtələri olan RNT şablonlarından 5′ terminal ardıcıllığı və cDNA əldə etmək üçün istifadə olunur.Ən uzun cDNT əldə etmək üçün hər bir RNT nümunəsində primerlərin RNT-yə nisbəti empirik olaraq müəyyən edilməlidir.Təsadüfi primerlərin ilkin konsentrasiyası 20μl reaksiya sistemi üçün 50 ilə 250 ng arasında dəyişir.Təsadüfi primerlərdən istifadə edərək ümumi RNT-dən sintez edilən cDNT əsasən ribosomal RNT olduğundan, şablon kimi ümumiyyətlə poli(A)+RNT seçilir.
Oliqo(dT) başlanğıcı təsadüfi primerlərdən daha spesifikdir.Əksər eukaryotik hüceyrələrdə mRNT-nin 3′ ucunda olan poli(A) quyruğu ilə hibridləşir.Poli(A)+RNT ümumi RNT-nin təqribən 1%-2%-ni təşkil etdiyi üçün cDNA-nın miqdarı və mürəkkəbliyi təsadüfi primerlərdən istifadə olunduğundan xeyli azdır.Yüksək spesifikliyinə görə oliqo(dT) ümumiyyətlə RNT-nin primer nisbəti və poli(A)+ seçimi üçün optimallaşdırma tələb etmir.20μl reaksiya sistemi üçün 0,5μg oliqo(dT) istifadə etmək tövsiyə olunur.oligo(dT)12-18 əksər RT-PCR üçün uyğundur.ThermoScript RT-PCR Sistemi yaxşı istilik sabitliyinə görə oliqo(dT)20 təmin edir və daha yüksək saxlama temperaturları üçün uyğundur.
Gen spesifik primerlər (GSP) əks transkripsiya mərhələsi üçün ən yaxşı spesifik primerlərdir.GSP, təsadüfi primerlər və ya oliqo(dT) kimi bütün Rnaları tavlamaqdansa, RNT təyinat ardıcıllığı ilə xüsusi olaraq hibridləşə bilən antisens oliqonukleoziddir.PCR primerlərinin dizaynı üçün istifadə edilən qaydalar GSP-nin əks transkripsiya reaksiyasının dizaynına da aiddir.GSP mRNA3′ sonunda tavlanmış gücləndirici primer ilə eyni ardıcıllıqla ola bilər və ya GSP əks gücləndirici primer ilə aşağı axınla tavlanmaq üçün dizayn edilə bilər.Bəzi gücləndirilmiş obyektlər üçün uğurlu RT-PCR üçün birdən çox antisens primer dizayn etmək lazımdır, çünki hədəf RNT-nin ikincil strukturu primerin bağlanmasına mane ola bilər.20μl-lik ilk zəncirvari sintez reaksiya sistemində 1pmol antisens GSP istifadə etmək təklif olunur.
2. Əks transkripsiyanın istilik qorunması temperaturunu artırın:
GSP spesifikliyindən tam istifadə etmək üçün yüksək termal sabitliyə malik əks transkriptazadan istifadə edilməlidir.Reaksiya sərtliyini artırmaq üçün istiliyə davamlı əks transkriptaz daha yüksək temperaturda izolyasiya edilə bilər.Məsələn, əgər GSP 55°C-də tavlanırsa, əks transkripsiya AMV və ya M-MLV istifadə edərək aşağı sərtliklə 37°C-də aparılırsa, GSP-nin spesifikliyi tam istifadə olunmur.Bununla belə, SuperScripⅡ və ThermoScript 50℃ və ya daha yüksək temperaturda reaksiya verə bilər ki, bu da daha aşağı temperaturda istehsal olunan qeyri-spesifik məhsulları aradan qaldırır.Maksimum spesifiklik üçün RNT/primer qarışığı əvvəlcədən isidilmiş 2 x reaksiya qarışığının (cDNA sintezinin istilik başlanğıcı) əlavə edilməsi ilə birbaşa 65℃ denaturasiya temperaturundan tərs transkripsiya saxlama temperaturuna köçürülə bilər.Bu, aşağı temperaturda molekullar arasında baza cütləşməsinin qarşısını almağa kömək edir.PCR alətindən istifadə RT-PCR üçün tələb olunan bir çox temperatur keçidlərini asanlaşdırır.
3. Genomik DNT çirklənməsini azaldın:
RT-PCR ilə bağlı potensial çətinliklərdən biri RNT-nin genomik DNT-ni çirkləndirməsidir.Trizol Reagent kimi daha yaxşı RNT ayırma üsullarının istifadəsi RNT preparatlarında genomik DNT çirklənməsini azaldır.Genomik DNT-dən istehsal olunan məhsulların qarşısını almaq üçün, əks transkripsiyadan əvvəl çirklənmiş DNT-ni çıxarmaq üçün RNT gücləndirici dərəcəli DnasⅠ ilə müalicə oluna bilər.Nümunələr DNaseⅠ həzmini dayandırmaq üçün 10 dəqiqə ərzində 2,0 mM EDTA-da 65 ℃ temperaturda saxlanıldı.EDTA yüksək temperaturda baş verən maqnezium ionundan asılı RNT hidrolizinin qarşısını almaq üçün maqnezium ionlarını xelatlaşdırır.
Gücləndirilmiş cDNT-ni genom DNT gücləndirmə məhsulundan ayırmaq üçün ayrılmış eksonla ayrıca bağlanan primerlər dizayn edilə bilər.cDNA-dan əldə edilən PCR məhsulları çirklənmiş genomik DNT-dən əldə edilənlərdən daha qısa olacaq.Verilmiş fraqmentin genomik DNT və ya cDNA-dan olub-olmadığını müəyyən etmək üçün hər bir RNT şablonunda əks transkripsiya olmadan idarə olunan təcrübə də aparılır.Əks transkripsiya olmadıqda əldə edilən PCR məhsulları genomdan əldə edilir.
Əlaqədar Məhsul
-Bir addımlı dəst əks transkripsiya və PCR-ni eyni boruda həyata keçirməyə imkan verir.Yalnız şablon RNT, xüsusi PCR primerləri və RNase-Free ddH əlavə etmək lazımdır2O.
-RNT-nin real vaxt rejimində kəmiyyət analizi tez və dəqiq həyata keçirilə bilər.
-Kit, gücləndirmə effektivliyini və reaksiyanın spesifikliyini effektiv şəkildə yaxşılaşdırmaq üçün unikal reaksiya sistemi ilə birləşdirilmiş unikal Foregene əks transkripsiya reagentindən və Foregene HotStar Taq DNT Polimerazından istifadə edir.
-Optimallaşdırılmış reaksiya sistemi reaksiyanın daha yüksək aşkarlama həssaslığına, daha güclü termal sabitliyə və daha yaxşı tolerantlığa malik olmasını təmin edir.
-2 dəqiqə ərzində şablondakı gDNT-ni çıxara bilən gDNT-ni çıxarmaq üçün effektiv qabiliyyət.
-Effektiv tərs transkripsiya sistemi, cDNT-nin birinci zəncirinin sintezini tamamlamaq üçün cəmi 15 dəqiqə çəkir.
-Mürəkkəb şablonlar: yüksək GC məzmunu və mürəkkəb ikinci dərəcəli strukturu olan şablonlar da yüksək effektivliklə geri çevrilə bilər.
-Yüksək həssaslığa malik tərs transkripsiya sistemi, pg səviyyəli şablonlar da yüksək keyfiyyətli cDNA əldə edə bilir.
-Tərs transkripsiya sistemi yüksək istilik sabitliyinə malikdir, optimal reaksiya temperaturu 42 ℃-dir və hələ də 50 ℃-də yaxşı tərs transkripsiya performansına malikdir.
Göndərmə vaxtı: 07 mart 2023-cü il
