一、Reaksiya sisteminin həssaslığını artırın:

1. Yüksək keyfiyyətli RNT-ni təcrid edin:

Uğurlu cDNA sintezi yüksək keyfiyyətli RNT-dən gəlir.Yüksək keyfiyyətli RNT ən azı tam uzunluqda olmalı və EDTA və ya SDS kimi əks transkriptaz inhibitorlarından azad olmalıdır.RNT keyfiyyəti cDNA-ya transkripsiya edə biləcəyiniz ardıcıllıq məlumatının maksimum miqdarını müəyyən edir.Ümumi RNT təmizləmə metodu guanidin izotiyosiyanat/turşu fenol istifadə edən bir addımlı üsuldur.İz miqdarda RNaz ilə çirklənmənin qarşısını almaq üçün RNaz ilə zəngin nümunələrdən (məsələn, mədəaltı vəzi) təcrid olunmuş RNT, xüsusilə uzunmüddətli saxlama üçün yüksək keyfiyyətli RNT-ni qorumaq üçün formaldehiddə saxlanmalıdır.Siçovul qaraciyərindən çıxarılan RNT bir həftə suda saxlandıqdan sonra əsasən parçalandı, siçovul dalağından çıxarılan RNT isə 3 il suda saxlandıqdan sonra sabit qaldı.Bundan əlavə, 4 kb-dən uzun olan transkriptlər kiçik transkriptlərə nisbətən iz RNazları tərəfindən deqradasiyaya daha həssasdır.Saxlanılan RNT nümunələrinin sabitliyini artırmaq üçün RNT deionlaşdırılmış formamiddə həll oluna və -70°C-də saxlanıla bilər.RNT-ni qorumaq üçün istifadə edilən formamid RNT-ni parçalayan zibildən təmizlənməlidir.Pankreasın RNT-si formamiddə ən azı bir il saxlanıla bilər.RNT-dən istifadə etməyə hazırlaşarkən, RNT-ni çökdürmək üçün aşağıdakı üsuldan istifadə edə bilərsiniz: 0,2M-ə və 4 dəfə həcmində etanola NaCl əlavə edin, otaq temperaturunda 3-5 dəqiqə qoyun və 10,000×q-da 5 dəqiqə sentrifuqa edin.

2. RNaseH-inaktiv (RNaseH-) əks transkriptazadan istifadə edin:

RNaz inhibitorları cDNT sintezinin uzunluğunu və məhsuldarlığını artırmaq üçün tez-tez tərs transkripsiya reaksiyalarına əlavə edilir.RNaz inhibitorları bufer və reduksiyaedici agentin (məsələn, DTT) iştirakı ilə birinci zəncirli sintez reaksiyası zamanı əlavə edilməlidir, çünki cDNT sintezindən əvvəlki proses inhibitoru denatürasiya edir və bununla da RNT-ni parçalaya bilən bağlı RNaz-ı buraxır.Protein RNase inhibitorları yalnız RNT-nin A, B, C RNase tərəfindən deqradasiyasına mane olur və dəridə RNaz-ın qarşısını almır, buna görə də bu inhibitorların istifadəsinə baxmayaraq, barmaqlarınızdan RNaz-ı daxil etməməyə diqqət yetirin.

Əks transkriptaza RNT-nin cDNT-yə çevrilməsini katalizləyir.Həm M-MLV, həm də AMV öz polimeraz fəaliyyətinə əlavə olaraq endogen RNaseH aktivliyinə malikdir.RNaseH aktivliyi və polimeraza aktivliyi RNT şablonu ilə DNT primeri və ya cDNT uzantısı zəncirində əmələ gələn hibrid zəncir üçün bir-biri ilə rəqabət aparır və RNT:DNT kompleksində RNT zəncirini deqradasiya edir.RNaseH aktivliyi ilə deqradasiyaya uğramış RNT şablonu cDNA sintezinin məhsuldarlığını və uzunluğunu azaldan cDNA sintezi üçün daha effektiv substrat kimi xidmət edə bilməz.Buna görə də, əks transkriptazın RNaseH aktivliyini aradan qaldırmaq və ya əhəmiyyətli dərəcədə azaltmaq faydalı olardı.

SuperScript Ⅱ tərs transkriptaza, RNaseH- MMLV tərs transkriptaza və termoScript əks transkriptaza, RNaseH- AMV, MMLV və AMV-dən daha çox miqdarda və daha tam uzunluqlu cDNA əldə edə bilər.RT-PCR həssaslığı cDNT sintezinin miqdarından təsirlənəcək.ThermoScript AMV-dən daha həssasdır.RT-PZR məhsullarının ölçüsü əks transkriptazın cDNA-nı sintez etmək qabiliyyəti ilə məhdudlaşır, xüsusən daha böyük cDNA-ların klonlanması zamanı.MMLV ilə müqayisədə SuperScripⅡ uzun RT-PCR məhsullarının məhsuldarlığını əhəmiyyətli dərəcədə artırdı.RNaseH-əks transkriptaza da artan termostabilliyə malikdir, buna görə də reaksiya normal 37-42°C-dən yüksək temperaturda həyata keçirilə bilər.Təklif olunan sintez şərtləri altında oliqo(dT) primeri və 10 μCi [α-P]dCTP istifadə edin.Birinci zolağın ümumi məhsuldarlığı TCA yağıntı üsulu ilə hesablanmışdır.Tam uzunluqlu cDNT, kəsilmiş və qələvi agaroza geldə sayılmış ölçülərə görə çeşidlənmiş zolaqlar istifadə edərək təhlil edilmişdir.

3. Əks transkripsiya üçün inkubasiya temperaturunu artırın:

Daha yüksək inkubasiya temperaturu reaksiyanın məhsuldarlığını artıraraq, RNT-nin ikincil strukturunu açmağa kömək edir.Əksər RNT şablonları üçün RNT və primerləri tampon və ya duz olmadan 65°C-də inkubasiya etmək, ardınca buz üzərində sürətli soyutma əksər ikinci dərəcəli strukturları aradan qaldıracaq və primerlərin bağlanmasına imkan verəcək.Bununla belə, bəzi şablonlar istilik denaturasiyasından sonra da ikinci dərəcəli strukturlara malikdir.Bu çətin şablonların gücləndirilməsi ThermoScript Reverse Transkriptaza istifadə edərək və gücləndirməni yaxşılaşdırmaq üçün əks transkripsiya reaksiyasını daha yüksək temperaturda yerləşdirməklə həyata keçirilə bilər.Yüksək inkubasiya temperaturları da spesifikliyi artıra bilər, xüsusən də cDNA sintezi üçün gen-spesifik primerlər (GSP) istifadə edildikdə (bax. Fəsil 3).GSP istifadə edirsinizsə, primerlərin Tm-nin gözlənilən inkubasiya temperaturu ilə eyni olduğundan əmin olun.60°C-dən yuxarı oliqo(dT) və təsadüfi primerlərdən istifadə etməyin.Təsadüfi primerlər 60°C-ə yüksəlməzdən əvvəl 25°C-də 10 dəqiqə inkubasiya tələb edir.Daha yüksək tərs transkripsiya temperaturundan istifadə etməklə yanaşı, spesifikliyi də RNT/primer qarışığını 65°C denaturasiya temperaturundan tərs transkripsiyanın inkubasiya temperaturuna birbaşa köçürməklə və əvvəlcədən isidilmiş 2× reaksiya qarışığını (cDNA isti başlanğıc sintezi) əlavə etməklə yaxşılaşdırmaq olar.Bu yanaşma daha aşağı temperaturda baş verən molekullararası baza cütləşməsinin qarşısını almağa kömək edir.RT-PCR üçün tələb olunan çoxlu temperaturun dəyişdirilməsi termal siklatordan istifadə etməklə sadələşdirilə bilər.

T-ci termostabil polimeraza Mg2+ varlığında DNT polimeraza, Mn2+ olduqda isə RNT polimeraza kimi çıxış edir.Maksimum 65°C temperaturda isti saxlanıla bilər.Bununla belə, PCR zamanı Mn2+ mövcudluğu sədaqəti azaldır, bu da Tth polimerazanı cDNT-nin klonlaşdırılması kimi yüksək dəqiqlikli gücləndirmə üçün daha az uyğun edir.Bundan əlavə, Tth həssaslığı azaldan aşağı tərs transkripsiya effektivliyinə malikdir və əks transkripsiya və PCR tək bir fermentlə həyata keçirilə bildiyinə görə, əks transkripsiya olmadan nəzarət reaksiyaları cDNT gücləndirmə məhsullarını çirkləndirici genomik DNT ilə müqayisə etmək üçün istifadə edilə bilməz.Gücləndirici məhsullar ayrıldı.

4. Əks transkripsiyanı təşviq edən əlavələr:

Birinci zəncirli sintez reaksiyasına qliserin və DMSO daxil olmaqla əlavələr əlavə edilir ki, bu da nuklein turşusunun ikiqat zəncirinin dayanıqlığını azalda və RNT-nin ikincil strukturunu ayıra bilər.SuperScript II və ya MMLV fəaliyyətinə təsir etmədən 20%-ə qədər qliserol və ya 10%-ə qədər DMSO əlavə edilə bilər.AMV həmçinin aktivliyini itirmədən 20%-ə qədər qliserola dözə bilir.SuperScriptⅡ tərs transkripsiya reaksiyasında RT-PCR həssaslığını artırmaq üçün 10% qliserol əlavə oluna və 45°C-də inkubasiya edilə bilər.Əgər əks transkripsiya reaksiyası məhsulunun 1/10 hissəsi PZR-ə əlavə olunarsa, o zaman gücləndirmə reaksiyasında qliserolun konsentrasiyası 0,4% təşkil edir ki, bu da PCR-nin qarşısını almaq üçün kifayət deyil.

5. RNaseH müalicəsi:

PCR-dən əvvəl cDNT sintez reaksiyalarının RNaseH ilə müalicəsi həssaslığı artıra bilər.Bəzi şablonlar üçün cDNA sintez reaksiyasında RNT-nin gücləndirmə məhsullarının bağlanmasının qarşısını aldığı düşünülür, bu halda RNaseH müalicəsi həssaslığı artıra bilər.Ümumiyyətlə, RNaseH müalicəsi daha uzun tam uzunluqlu cDNA hədəf şablonlarını gücləndirərkən zəruridir, məsələn, aşağı nüsxəli yumru skerozu II.Bu çətin şablon üçün RNaseH müalicəsi SuperScript II və ya AMV-sintezləşdirilmiş cDNA tərəfindən istehsal olunan siqnalı gücləndirdi.Əksər RT-PCR reaksiyaları üçün RNaseH müalicəsi isteğe bağlıdır, çünki 95°C-də PCR denaturasiya mərhələsi ümumiyyətlə RNT:DNT kompleksində RNT-ni hidroliz edir.

6. Kiçik RNT Aşkarlama Metodunun Təkmilləşdirilməsi:

Yalnız kiçik miqdarda RNT mövcud olduqda RT-PCR xüsusilə çətin olur.RNT izolyasiyası zamanı daşıyıcı kimi əlavə edilən glikogen kiçik nümunələrin məhsuldarlığını artırmağa kömək edir.Trizol əlavə etməklə eyni vaxtda RNazsız glikogen əlavə edilə bilər.Glikogen suda həll olunur və sonrakı yağışa kömək etmək üçün RNT ilə sulu fazada saxlanıla bilər.50 mq toxuma və ya 106 kultura hüceyrədən az nümunələr üçün RNazsız qlikogenin tövsiyə olunan konsentrasiyası 250 mkq/ml təşkil edir.

SuperScript II istifadə edərək əks transkripsiya reaksiyasına asetilləşdirilmiş BSA əlavə edilməsi həssaslığı artıra bilər və kiçik miqdarda RNT üçün SuperScript II miqdarının azaldılması və 40 vahid RNaseOut nukleaza inhibitorunun əlavə edilməsi aşkarlanma səviyyəsini artıra bilər.Əgər qlikogen RNT təcrid prosesində istifadə olunursa, əks transkripsiya reaksiyası üçün SuperScript II istifadə edərkən yenə də BSA və ya RNase inhibitorunu əlavə etmək tövsiyə olunur.

məsələn, RT-PCR spesifikliyini artırın

1. CND Asintezi:

Birinci zəncirli cDNA sintezi üç müxtəlif üsuldan istifadə etməklə başlana bilər, onların nisbi spesifikliyi sintez edilən cDNT-nin miqdarına və növünə təsir göstərir.

Təsadüfi primer metodu üç üsuldan ən az spesifik idi.Primerlər, qısa, qismən uzunluqlu cDNA-lar yaradaraq, transkript boyu bir çox yerdə bağlanır.Bu üsul tez-tez 5′ son ardıcıllığı əldə etmək və əks transkriptaza ilə təkrarlana bilməyən ikincil struktur bölgələri və ya son nöqtələri olan RNT şablonlarından cDNA əldə etmək üçün istifadə olunur.Ən uzun cDNT əldə etmək üçün hər bir RNT nümunəsində primerlərin RNT-yə nisbəti empirik olaraq müəyyən edilməlidir.Təsadüfi primerlərin başlanğıc konsentrasiyası 20 μl reaksiya üçün 50 ilə 250 ng arasında dəyişdi.Təsadüfi primerlərdən istifadə edərək ümumi RNT-dən sintez edilən cDNA əsasən ribosomal RNT olduğundan, şablon kimi ümumiyyətlə poli(A)+RNT seçilir.

Oliqo(dT) primerləri təsadüfi primerlərdən daha spesifikdir.Əksər eukaryotik mRNT-lərin 3′ ucunda yerləşən poli(A) quyruğuna hibridləşir.Poli(A)+ RNT ümumi RNT-nin təqribən 1%-2%-ni təşkil etdiyi üçün cDNA-nın miqdarı və mürəkkəbliyi təsadüfi primerlərlə müqayisədə çox azdır.Yüksək spesifikliyinə görə oliqo(dT) ümumiyyətlə RNT-nin primerlərə nisbətinin optimallaşdırılmasını və poli(A)+ seçimini tələb etmir.20μl reaksiya sistemi üçün 0,5μg oliqo(dT) istifadə etmək tövsiyə olunur.oligo(dT)12-18 əksər RT-PCR üçün uyğundur.ThermoScript RT-PCR Sistemi daha yüksək inkubasiya temperaturları üçün daha yaxşı istilik sabitliyinə görə oliqo(dT)20 təklif edir.

Gen spesifik primerlər (GSP) əks transkripsiya mərhələsi üçün ən spesifik primerlərdir.GSP, bütün RNT-lərə bağlanan təsadüfi primerlərdən və ya oliqodan (dT) fərqli olaraq, RNT hədəf ardıcıllığına xüsusi olaraq hibridləşə bilən antisens oliqonukleotiddir.PZR primerlərinin dizaynı üçün istifadə edilən eyni qaydalar tərs transkripsiya reaksiyalarında GSP dizaynına tətbiq edilir.GSP mRNT-nin 3′-ən ucuna bağlanan gücləndirici primer ilə eyni ardıcıllıqla ola bilər və ya GSP tərs gücləndirici primerin aşağı axınında bağlanmaq üçün dizayn edilə bilər.Bəzi gücləndirilmiş subyektlər üçün uğurlu RT-PCR üçün birdən çox antisens primer hazırlanmalıdır, çünki hədəf RNT-nin ikincil strukturu primerin bağlanmasına mane ola bilər.20 μl birinci zəncir sintez reaksiyasında 1 pmol antisens GSP istifadə etmək tövsiyə olunur.

2. Əks transkripsiya üçün inkubasiya temperaturunu qaldırın:

GSP spesifikliyinin tam üstünlüyündən tam istifadə etmək üçün daha yüksək termostabilliyə malik əks transkriptazadan istifadə edilməlidir.Termostabil əks transkriptazalar reaksiyanın sərtliyini artırmaq üçün daha yüksək temperaturda inkubasiya edilə bilər.Məsələn, GSP 55°C-də qızdırılırsa, AMV və ya M-MLV 37°C aşağı sərtlikdə əks transkripsiya üçün istifadə edilərsə, GSP-nin spesifikliyi tam istifadə olunmayacaq.Bununla belə, SuperScript II və ThermoScript 50°C və ya daha yüksək temperaturda reaksiya verə bilər ki, bu da daha aşağı temperaturda yaranan qeyri-spesifik məhsulları aradan qaldıracaq.Maksimum spesifiklik üçün RNT/primer qarışığı birbaşa 65°C denaturasiya temperaturundan tərs transkripsiya inkubasiya temperaturuna köçürülə və əvvəlcədən isidilmiş 2× reaksiya qarışığına əlavə oluna bilər (cDNA sintezi isti başlanğıc).Bu, aşağı temperaturda molekullararası baza cütləşməsinin qarşısını alır.RT-PCR üçün tələb olunan çoxsaylı temperatur keçidləri bir termal siklatordan istifadə etməklə sadələşdirilə bilər.

3. Genomik DNT çirklənməsini azaldır:

RT-PCR ilə qarşılaşılan potensial çətinlik RNT-də genomik DNT-nin çirklənməsidir.Trizol Reagent kimi yaxşı RNT təcrid üsulundan istifadə RNT preparatını çirkləndirən genomik DNT-nin miqdarını azaldacaq.Genomik DNT-dən əldə edilən məhsulların qarşısını almaq üçün, əks transkripsiyadan əvvəl çirkləndirici DNT-ni çıxarmaq üçün RNT gücləndirici dərəcəli DNase I ilə müalicə edilə bilər.Nümunələrin 2,0 mM EDTA-da 10 dəqiqə 65°C-də inkubasiyası ilə DNaz I həzmi dayandırıldı.EDTA yüksək temperaturda maqnezium ionundan asılı RNT hidrolizinin qarşısını alaraq maqnezium ionlarını xelatlaşdıra bilir.

Gücləndirilmiş cDNT-ni çirkləndirici genomik DNT gücləndirmə məhsullarından ayırmaq üçün primerlər dizayn edilə bilər ki, hər biri eksonları ayırmaq üçün bağlansın.cDNA-dan əldə edilən PCR məhsulları çirklənmiş genomik DNT-dən əldə edilənlərdən daha qısa olacaq.Bundan əlavə, verilmiş fraqmentin genomik DNT və ya cDNA-dan əldə edilib-edilmədiyini müəyyən etmək üçün hər bir RNT şablonunda əks transkripsiya olmadan nəzarət təcrübəsi aparılmışdır.Əks transkripsiya olmadan əldə edilən PCR məhsulu genomdan əldə edilir.