Ümumi baxış
Transgen bitkilərin sürətli identifikasiyası
Mətn/Tong Yucheng
Eksperimental əməliyyat/Han Ying
Redaktor/Ven Youjun
Sözlər/1600+
Təklif olunan oxuma vaxtı/8-10 dəqiqə
Transgen bitkilərin sürətli identifikasiyası
Laboratoriyada yeni gələn kimi, aşağı çevrilmə dərəcəsi olan bir dəstə bitkidən müsbət bitkiləri ayırmaq yaxşı iş deyil.Əvvəlcə çoxlu sayda nümunədən bir-bir DNT çıxarılmalı, sonra yad genlər PZR ilə aşkarlanacaqdır.Bununla belə, nəticələr tez-tez boşluqlar və bir neçə elementdən ibarət lentlər olur, lakin buraxılmış aşkarlamaların və ya yanlış aşkarlamaların olub olmadığını müəyyən etmək mümkün deyil..Belə eksperimental proses və nəticələrlə üzləşmək çox acizdirmi?Narahat olmayın, qardaş sizə transgen pozitiv bitkiləri asanlıqla və dəqiq şəkildə süzgəcdən keçirməyi öyrədir.
Addım 1: Dizayn aşkarlama primerləri
Sınaq ediləcək nümunəyə uyğun olaraq aşkar ediləcək endogen geni və ekzogen geni təyin edin və primer dizaynı üçün gendə 100-500bp-lik təmsilçi ardıcıllığı seçin.Yaxşı primerlər aşkarlama nəticələrinin düzgünlüyünü təmin edə və aşkarlama müddətini qısalda bilər (ümumiyyətlə istifadə olunan aşkarlama primerləri üçün əlavəyə baxın).
Qeyd:
Yeni dizayn edilmiş primerlər geniş miqyaslı aşkarlama həyata keçirməzdən əvvəl reaksiya şəraitini optimallaşdırmalı və aşkarlamanın dəqiqliyini, dəqiqliyini və aşkarlama həddini yoxlamalıdır.
Addım 2:Eksperimental protokol hazırlayın
Müsbət nəzarət: PCR reaksiya sisteminin və şərtlərinin normal olub olmadığını müəyyən etmək üçün şablon kimi hədəf fraqmenti ehtiva edən təmizlənmiş DNT-dən istifadə edin.
Mənfi/boş nəzarət: DNT şablonu və ya ddH istifadə edin2PCR sistemində çirklənmə mənbəyinin olub olmadığını aşkar etmək üçün şablon kimi hədəf fraqmenti ehtiva etməyən O.
Daxili istinad nəzarəti: şablonun PCR ilə aşkarlana biləcəyini qiymətləndirmək üçün sınaqdan keçiriləcək nümunənin endogen geninin primer/zond birləşməsindən istifadə edin.
Qeyd:
Təcrübə nəticələrinin etibarlılığını qiymətləndirmək üçün hər bir test üçün müsbət, mənfi/boş nəzarətlər və daxili nəzarət nəzarətləri təyin edilməlidir.
Addım 3: Təcrübə hazırlığı
İstifadədən əvvəl məhlulun bərabər şəkildə qarışdırılıb-qarışmadığına diqqət yetirin.Çöküntü aşkar edilərsə, istifadə etməzdən əvvəl təlimatlara uyğun olaraq həll edilməli və qarışdırılmalıdır.2×PCR qarışığı ionların qeyri-bərabər paylanmasının qarşısını almaq üçün istifadə etməzdən əvvəl pipetlənməli və təkrar-təkrar mikropipetlə qarışdırılmalıdır.
Qeyd:
Təlimatları çıxarın və diqqətlə oxuyun və təlimatlara ciddi şəkildə uyğun olaraq təcrübədən əvvəl hazırlıq aparın.
Addım 4: PCR reaksiya sistemini hazırlayın
Eksperimental protokola görə, primerləri qarışdırın, H2O, 2×PCR qarışdırın, sentrifuqa edin və hər bir reaksiya borusuna paylayın.
Qeyd:
Genişmiqyaslı və ya uzunmüddətli sınaqlar üçün tərkibində UNG fermenti olan PCR reaksiya sistemindən istifadə etmək tövsiyə olunur ki, bu da PCR məhsullarının yaratdığı aerozol çirklənməsinin qarşısını effektiv şəkildə ala bilir.
Addım 5: Reaksiya şablonu əlavə edin
Direct PCR texnologiyasından istifadə edərək, yorucu nuklein turşusunun təmizlənməsi prosesinə ehtiyac yoxdur.Nümunə şablonu 10 dəqiqə ərzində hazırlana və müvafiq PCR reaksiya sisteminə əlavə oluna bilər.
Qeyd:
Lizis metodu daha yaxşı aşkarlama effektinə malikdir və əldə edilən məhsul çoxsaylı aşkarlama reaksiyaları üçün istifadə edilə bilər.
5.1: Yarpaqların birbaşa PCR
Təlimatdakı şəklin ölçüsünə uyğun olaraq 2-3 mm diametrli yarpaq toxumasını kəsin və PCR reaksiya sisteminə qoyun.
Qeyd: Yarpaq fraqmentlərinin tamamilə PCR reaksiya məhluluna batırıldığından əmin olun və həddindən artıq yarpaq toxuması əlavə etməyin.
5.2: Yarpaqların parçalanması üsulu
5-7 mm diametrli yarpaq toxumasını kəsin və bir sentrifuqa borusuna qoyun.Yetkin yarpaqları seçsəniz, yarpağın əsas damarının toxumalarından istifadə etməyin.Lizatın yarpaq toxumasını tamamilə batırmasını təmin etmək üçün 50ul Bufer P1 lizatını pipetlə sentrifuqa borusuna çəkin, onu termal siklatora və ya metal vannaya yerləşdirin və 95°C-də 5-10 dəqiqə lizinq edin.
50ul Buffer P2 neytrallaşdırma məhlulu əlavə edin və yaxşı qarışdırın.Alınan lizat şablon kimi istifadə oluna və PCR reaksiya sisteminə əlavə edilə bilər.
Qeyd: Şablonun miqdarı PCR sisteminin 5-10%-i arasında olmalıdır və 20%-dən çox olmamalıdır (məsələn, 20μl PCR sistemində 1-2μl liziz tamponu əlavə edin, 4μl-dən çox olmamalıdır).
Addım 6: PCR reaksiyası
PCR reaksiya borusunu sentrifuqa etdikdən sonra gücləndirmək üçün onları PCR alətinə qoyun.
Qeyd:
Reaksiya gücləndirmə üçün təmizlənməmiş şablondan istifadə edir, ona görə də gücləndirmə dövrlərinin sayı təmizlənmiş DNT şablonundan istifadə ilə müqayisədə 5-10 dövrə çoxdur.
Addım 7: Elektroforez aşkarlanması və nəticələrin təhlili
M:100bp DNT Nərdivanı
1\4: Təmizlənmiş DNT üsulu
2\5: Birbaşa PCR üsulu
3\6: Boş nəzarət
Keyfiyyətə nəzarət:
Təcrübədə müəyyən edilmiş müxtəlif nəzarət vasitələrinin sınaq nəticələri aşağıdakı şərtlərə cavab verməlidir.Əks halda problemin səbəbi təhlil edilməli, problem aradan qaldırıldıqdan sonra yenidən test aparılmalıdır.
Cədvəl 1. Müxtəlif nəzarət qruplarının normal test nəticələri
*Plazmid müsbət nəzarət kimi istifadə edildikdə, endogen gen testinin nəticəsi mənfi ola bilər
Nəticə mühakimə:
A. Nümunənin endogen geninin test nəticəsi mənfidir, bu onu göstərir ki, adi PCR aşkarlanması üçün uyğun olan DNT nümunədən çıxarıla bilməz və ya çıxarılan DNT-də PCR reaksiya inhibitorları var və DNT yenidən ekstraksiya edilməlidir.
B. Nümunənin endogen geninin test nəticəsi müsbət, ekzogen genin test nəticəsi mənfidir, bu, nümunədən adi PCR aşkarlanması üçün uyğun olan DNT-nin çıxarıldığını göstərir və nümunədə XXX geninin aşkar edilmədiyinə dair mühakimə edilə bilər.
C. Nümunənin endogen geninin test nəticəsi müsbət, ekzogen genin test nəticəsi müsbətdir, bu nümunədən adi PCR aşkarlanması üçün uyğun DNT-nin çıxarıldığını və nümunə DNT-nin tərkibində XXX geni olduğunu göstərir.Təsdiq eksperimentləri əlavə edilə bilər.
Addım 8: aşkarlama primerlərinin dizaynı
Təcrübədən sonra ətraf mühitin çirklənməsinin qarşısını almaq üçün eksperimental ərazini silmək üçün 2% natrium hipoxlorit məhlulu və 70% etanol məhlulundan istifadə edin.
Əlavə
Cədvəl 2. Genetik cəhətdən dəyişdirilmiş bitkilərin ümumi PCR aşkarlanması üçün ümumi istifadə olunan primerlər
İstinad sənədi:
SN/T 1202-2010, Qidada genetik cəhətdən dəyişdirilmiş bitki inqrediyentləri üçün Keyfiyyətli PCR aşkarlama üsulu.
Kənd Təsərrüfatı Nazirliyinin Elan 1485-5-2010, Genetik cəhətdən dəyişdirilmiş bitkilərin və onların məhsullarının - düyü M12 və onun törəmələrinin inqrediyentlərinin sınaqdan keçirilməsi.
Göndərmə vaxtı: 09 iyun 2021-ci il
