Laboratoriyada yeni olan kimi, aşağı çevrilmə nisbəti olan bir dəstə bitkidən müsbət bitkiləri ayırmaq yaxşı iş deyil.Əvvəlcə çoxlu sayda nümunədən bir-bir DNT çıxarılmalı, sonra yad genlər PZR ilə aşkarlanacaqdır.Bununla belə, nəticələr tez-tez boşluqlar və bir neçə elementdən ibarət lentlər olur, lakin buraxılmış aşkarlamaların və ya yanlış aşkarlamaların olub olmadığını müəyyən etmək mümkün deyil..Belə eksperimental proses və nəticələrlə üzləşmək çox acizdirmi?Narahat olmayın, qardaş sizə transgen pozitiv bitkiləri asanlıqla və dəqiq şəkildə süzgəcdən keçirməyi öyrədir.

Addım 1

Dizayn aşkarlama primerləri

Sınaq ediləcək nümunəyə uyğun olaraq aşkar ediləcək endogen geni və ekzogen geni təyin edin və primer dizaynı üçün gendə 100-500bp-lik təmsilçi ardıcıllığı seçin.Yaxşı primerlər aşkarlama nəticələrinin düzgünlüyünü təmin edə və aşkarlama müddətini qısalda bilər (ümumiyyətlə istifadə olunan aşkarlama primerləri üçün əlavəyə baxın).

Xəbərdarlıq: Yeni dizayn edilmiş primerlər geniş miqyaslı aşkarlamadan əvvəl reaksiya şəraitini optimallaşdırmalı və aşkarlamanın dəqiqliyini, dəqiqliyini və aşkarlama həddini yoxlamalıdır.

Addım 2

Eksperimental protokolun dizaynı

Müsbət nəzarət: PCR reaksiya sisteminin və şərtlərinin normal olub olmadığını müəyyən etmək üçün şablon kimi hədəf fraqmenti ehtiva edən təmizlənmiş DNT-dən istifadə edin.

Mənfi/boş nəzarət: PCR sistemində çirklənmə mənbəyinin olub-olmadığını aşkar etmək üçün şablon kimi hədəf fraqmenti ehtiva etməyən DNT şablonundan və ya ddH2O-dan istifadə edin.

Daxili istinad nəzarəti: şablonun PCR ilə aşkarlana biləcəyini qiymətləndirmək üçün sınaqdan keçiriləcək nümunənin endogen geninin primer/zond birləşməsindən istifadə edin.

Xəbərdarlıq:

Təcrübə nəticələrinin etibarlılığını qiymətləndirmək üçün hər bir test üçün müsbət, mənfi/boş nəzarətlər və daxili nəzarət nəzarətləri təyin edilməlidir.

Təcrübə hazırlığı

İstifadədən əvvəl məhlulun bərabər şəkildə qarışdırılıb-qarışmadığına diqqət yetirin.Çöküntü aşkar edilərsə, istifadə etməzdən əvvəl təlimatlara uyğun olaraq həll edilməli və qarışdırılmalıdır.2×PCR qarışığı ionların qeyri-bərabər paylanmasının qarşısını almaq üçün istifadə etməzdən əvvəl pipetlənməli və təkrar-təkrar mikropipetlə qarışdırılmalıdır.

Xəbərdarlıq:

Təlimatı çıxarın və diqqətlə oxuyun və təlimatın tələblərinə ciddi uyğun olaraq təcrübədən əvvəl hazırlıq işləri aparın.

Addım 4

PCR reaksiya sistemini hazırlayın

Eksperimental protokola əsasən, primerləri, H2O və 2×PCR qarışığını bərabər şəkildə qarışdırın, sentrifuqa edin və hər bir reaksiya borusuna paylayın.

Xəbərdarlıq:

Genişmiqyaslı və ya uzunmüddətli sınaqlar üçün tərkibində UNG fermenti olan PCR reaksiya sistemindən istifadə etmək tövsiyə olunur ki, bu da PCR məhsullarının yaratdığı aerozol çirklənməsinin qarşısını effektiv şəkildə ala bilir.

Addım 5

Reaksiya şablonu əlavə edin

Direct PCR texnologiyasından istifadə edərək, yorucu nuklein turşusunun təmizlənməsi prosesinə ehtiyac yoxdur, nümunə şablonu 10 dəqiqə ərzində hazırlana bilər və müvafiq PCR reaksiya sistemi əlavə edilə bilər.

Xəbərdarlıq:

Parçalanma üsulu daha yaxşı aşkarlama effektinə malikdir və əldə edilən məhsul çoxsaylı aşkarlama reaksiyaları üçün istifadə oluna bilər.

5.1: Yarpaqların birbaşa genişlənməsi

Təlimatdakı şəklin ölçüsünə uyğun olaraq 2-3 mm diametrli yarpaq toxumasını kəsin və PCR reaksiya sisteminə qoyun.

Qeyd: Yarpaq fraqmentlərinin tamamilə PCR reaksiya məhluluna batırıldığından əmin olun və həddindən artıq yarpaq toxuması əlavə etməyin.

5.2: Yarpaqların parçalanması üsulu

5-7 mm diametrli yarpaq toxumasını kəsin və bir sentrifuqa borusuna qoyun.Yetkin yarpaqları seçsəniz, yarpağın əsas damarının toxumalarından istifadə etməyin.Lizatın yarpaq toxumasını tamamilə batırmasını təmin etmək üçün 50ul Bufer P1 lizatını pipetlə sentrifuqa borusuna çəkin, onu termal siklatora və ya metal vannaya yerləşdirin və 95°C-də 5-10 dəqiqə lizinq edin.

50ul Buffer P2 neytrallaşdırma məhlulu əlavə edin və yaxşı qarışdırın.Alınan lizat şablon kimi istifadə oluna və PCR reaksiya sisteminə əlavə edilə bilər.

Qeyd: Şablonun miqdarı PCR sisteminin 5-10%-i arasındadır və 20%-dən çox olmamalıdır (məsələn, 20μl PCR sistemində 1-2μl lizis məhlulu əlavə edin, 4μl-dən çox olmamalıdır).

Addım 6

PCR reaksiyası

PCR reaksiya borusunu sentrifuqa etdikdən sonra gücləndirmək üçün PCR alətinə yerləşdirilir.

Xəbərdarlıq:

Reaksiya gücləndirmə üçün təmizlənməmiş şablondan istifadə edir, ona görə də gücləndirmə dövrlərinin sayı təmizlənmiş DNT şablonundan istifadə ilə müqayisədə 5-10 dövrə çoxdur.

Addım 7

Elektroforezin aşkarlanması və nəticələrin təhlili

M: 100bp DNT Nərdivanı

1\4: Təmizlənmiş DNT üsulu

2\5: Birbaşa PCR üsulu

3\6: Boş nəzarət

QC:

Təcrübədə müəyyən edilmiş müxtəlif nəzarət vasitələrinin sınaq nəticələri aşağıdakı şərtlərə cavab verməlidir.Əks halda problemin səbəbi təhlil edilməli, problem aradan qaldırıldıqdan sonra yenidən test aparılmalıdır.

Cədvəl 1. Müxtəlif nəzarət qruplarının normal test nəticələri

*Plazmid müsbət nəzarət kimi istifadə edildikdə, endogen gen testinin nəticəsi mənfi ola bilər

Nəticə mühakimə:

A. Nümunənin endogen geninin test nəticəsi mənfidir, bu onu göstərir ki, adi PCR aşkarlanması üçün uyğun olan DNT nümunədən çıxarıla bilməz və ya çıxarılan DNT-də PCR reaksiya inhibitorları var və DNT yenidən ekstraksiya edilməlidir.

B. Nümunənin endogen geninin test nəticəsi müsbət, ekzogen genin test nəticəsi mənfidir, bu nümunədən adi PCR aşkarlanması üçün uyğun DNT-nin çıxarıldığını göstərir və nümunədə XXX geninin aşkar edilmədiyinə dair mühakimə oluna bilər.

C. Nümunənin endogen geninin test nəticəsi müsbətdir və ekzogen genin test nəticəsi müsbətdir, bu nümunədən adi PCR aşkarlanması üçün uyğun DNT-nin çıxarıldığını göstərir və nümunə DNT-də XXX geni var.Təsdiq eksperimentləri əlavə edilə bilər.

Addım 8

Dizayn aşkarlama primerləri

Təcrübədən sonra ətraf mühitin çirklənməsinin qarşısını almaq üçün eksperimental ərazini silmək üçün 2% natrium hipoxlorit məhlulu və 70% etanol məhlulu istifadə edin.