RT-qPCR adi PCR texnologiyasından hazırlanmışdır.O, ənənəvi PCR reaksiya sisteminə flüoresan kimyəvi maddələr (flüoresan boyalar və ya flüoresan zondlar) əlavə edir və müxtəlif lüminesans mexanizmlərinə uyğun olaraq real vaxt rejimində PCR tavlama və uzatma prosesini aşkarlayır.Mühitdə flüoresan siqnal dəyişiklikləri PCR-nin hər bir dövründə məhsulun dəyişməsinin miqdarını hesablamaq üçün istifadə olunur.Hal-hazırda ən çox yayılmış üsullar floresan boyama üsulu və zond üsuludur.

Floresan boyama üsulu:
Bəzi flüoresan boyalar, məsələn, SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO və s., öz-özünə işıq yaymır, lakin dsDNA-nın kiçik yivinə bağlandıqdan sonra flüoresan saçır.Buna görə də, PCR reaksiyasının başlanğıcında maşın flüoresan siqnalı aşkar edə bilmir.Reaksiya tavlama-uzatma (iki pilləli üsul) və ya uzadılma mərhələsinə (üç pilləli üsul) keçdikdə, bu zaman qoşa zəncirlər açılır və yeni DNT polimeraza Tel sintezi zamanı flüoresan molekullar dsDNA kiçik yivində birləşir və flüoresan saçır.PCR dövrlərinin sayı artdıqca, getdikcə daha çox boyalar dsDNA ilə birləşir və flüoresan siqnal da davamlı olaraq gücləndirilir.Nümunə olaraq SYBR Green Ⅰ götürün.
Prob üsulu:
Taqman zondu ən çox istifadə edilən hidroliz zondudur.Zondun 5′ ucunda flüoresan qrupu var, adətən FAM.Probun özü hədəf geni tamamlayan bir ardıcıllıqdır.Flüoroforun 3′ ucunda flüoresan söndürmə qrupu var.Flüoresan rezonans enerjisinin ötürülməsi prinsipinə əsasən (Förster rezonans enerjisinin ötürülməsi, FRET), məruzəçi flüoresan qrupu (donor flüoresan molekulu) və söndürən flüoresan qrupu (qəbuledici flüoresan molekul) həyəcan spektri üst-üstə düşdükdə və məsafə çox yaxın olduqda (7-10 nm fluoressensiya vericisi), qəbuledici molekul, avtoflüoressensiya isə zəifləyir.Buna görə də, PCR reaksiyasının başlanğıcında, zond sistemdə sərbəst və bütöv olduqda, reportyor flüoresan qrupu flüoresans yaymayacaq.Yuvlama zamanı primer və zond şablona bağlanır.Uzatma mərhələsində polimeraza davamlı olaraq yeni zəncirləri sintez edir.DNT polimeraza 5′-3′ eksonükleaz aktivliyinə malikdir.Proba çatdıqda, DNT polimeraza probu şablondan hidroliz edəcək, məruzəçi flüoresan qrupunu söndürən flüoresan qrupundan ayıracaq və flüoresan siqnalı buraxacaq.Zond ilə şablon arasında tək-tək əlaqə olduğu üçün sınağın dəqiqliyi və həssaslığı baxımından zond üsulu boyama üsulundan üstündür.

Şəkil 1 qRT-PCR prinsipi

Astar dizaynı
Prinsiplər:

Primerlər nuklein turşusu seriyasının qorunan bölgəsində dizayn edilməli və spesifikliyə malik olmalıdır.

Ən yaxşısı cDNA ardıcıllığından istifadə etməkdir və mRNT ardıcıllığı da məqbuldur.Əgər deyilsə, DNT ardıcıllığının cds bölgə dizaynını tapın.
Floresan kəmiyyət məhsulunun uzunluğu 80-150bp, ən uzunu 300bp, primer uzunluğu ümumiyyətlə 17-25 baza arasındadır və yuxarı və aşağı astarlar arasındakı fərq çox böyük olmamalıdır.

G+C məzmunu 40% ilə 60% arasındadır və 45-55% ən yaxşısıdır.
TM dəyəri 58-62 dərəcə arasındadır.
Primer dimerlərdən və self-dimerlərdən qaçınmağa çalışın, (ardıcıl olaraq 4 cütdən çox bir-birini tamamlayan əsaslar görünməməlidir) saç tıxacının quruluşu, qaçınılmazdırsa, ΔG<4.5kJ/mol* edin. Əgər tərs transkripsiya zamanı gDNA-nın təmizləndiyinə əmin ola bilmirsinizsə, intronun primerlərini dizayn etmək daha yaxşıdır *3/C-nin modifikasiya olunmaması üçün intronun primerlərini dizayn etmək lazımdır *3/C, A/G davamlı struktur (2-3) primerlər və qeyri-
spesifik Heterojen şəkildə gücləndirilmiş ardıcıllığın homologiyası tercihen 70%-dən azdır və ya 8 tamamlayıcı əsas homologiyaya malikdir.
Verilənlər bazası:
Açar sözlərlə CottonFGD axtarışı
Astar dizaynı:
IDT-qPCR primer dizaynı

Fig2 IDT onlayn primer dizayn aləti səhifəsi

Şəkil 3 nəticə səhifəsinin ekranı
lncRNA primerlərinin dizaynı:
lncRNA:mRNT ilə eyni addımlar.
miRNA:Stem-loop metodunun prinsipi: Bütün miRNA-lar təqribən 23 nt-lik qısa ardıcıllıqlar olduğundan, birbaşa PCR aşkarlanması həyata keçirilə bilməz, buna görə də gövdə-halqa ardıcıllığı alətindən istifadə olunur.Kök-döşək ardıcıllığı təxminən 50 nt-lik tək zəncirli DNT-dir və özü də saç sancağı quruluşunu yarada bilir.3 'Ucu miRNA-nın qismən fraqmentini tamamlayan ardıcıllıq kimi tərtib oluna bilər, sonra hədəf miRNA əks transkripsiya zamanı gövdə-halqa ardıcıllığına qoşula bilər və ümumi uzunluq 70bp-ə çata bilər ki, bu da qPCR ilə müəyyən edilən gücləndirilmiş məhsulun uzunluğuna uyğundur.Quyruq miRNA primer dizaynı.
Gücləndirməyə xüsusi aşkarlama:
Onlayn partlayış məlumat bazası: Ardıcıllıq oxşarlığına görə CottonFGD partlayışı
Yerli partlayış: Yerli partlayış etmək üçün Blast+ istifadə edin, linux və macos birbaşa yerli verilənlər bazası yarada bilər, win10 sistemi də ubuntu bash quraşdırdıqdan sonra edilə bilər.Yerli partlayış məlumat bazası və yerli partlayış yaradın;win10-da ubuntu bash açın.
Qeyd: Dağlıq pambıq və dəniz adasında pambıq tetraploid bitkilərdir, buna görə də partlayışın nəticəsi çox vaxt iki və ya daha çox kibrit olacaq.Keçmişdə partlayış yerinə yetirmək üçün verilənlər bazası kimi NAU cd-lərindən istifadə etməklə, çox güman ki, yalnız bir neçə SNP fərqi olan iki homoloji gen tapılacaq.Adətən, iki homoloji gen primer dizaynı ilə ayrıla bilməz, buna görə də onlara eyni şəkildə baxılır.Aşkar bir indel varsa, primer adətən indel üzərində tərtib edilir, lakin bu, primerin ikincil strukturuna səbəb ola bilər Sərbəst enerji daha yüksək olur, gücləndirmə səmərəliliyinin azalmasına səbəb olur, lakin bu qaçılmazdır.

Primer ikincili strukturun aşkarlanması:
Addımlar:oliqo 7-ni açın → daxiletmə şablonunun ardıcıllığını bağlayın → alt pəncərəni bağlayın → yadda saxla → şablonda primeri tapın, primerin uzunluğunu təyin etmək üçün ctrl+D düymələrini basın → özünü dimerləşmə gövdəsi, heterodimer, saç sancağı, uyğunsuzluq və s. kimi müxtəlif ikinci dərəcəli strukturları təhlil edin. Şəkil 4-dəki son iki şəkil primerlərin sınaq nəticələridir.Ön primerin nəticəsi yaxşıdır, açıq-aşkar dimer və hairpin strukturu yoxdur, davamlı tamamlayıcı əsaslar yoxdur və sərbəst enerjinin mütləq dəyəri 4,5-dən azdır, arxa primer isə davamlı göstərir 6 əsas tamamlayıcıdır və sərbəst enerji 8,8;əlavə olaraq, 3′ ucunda daha ciddi bir dimer görünür və ardıcıl 4 əsasdan ibarət dimer görünür.Sərbəst enerji yüksək olmasa da, 3′ dimer Chl gücləndirmə spesifikliyinə və gücləndirmə səmərəliliyinə ciddi təsir göstərə bilər.Bundan əlavə, saç tıxacları, heterodimerlər və uyğunsuzluqları yoxlamaq lazımdır.

Fig3 oliqo7 aşkarlama nəticələri
Gücləndirmə səmərəliliyinin aşkarlanması:
PCR reaksiyasının gücləndirmə effektivliyi PCR nəticələrinə ciddi təsir göstərir.Həmçinin qRT-PCR-də gücləndirmə səmərəliliyi kəmiyyət nəticələri üçün xüsusilə vacibdir.Reaksiya tamponunda digər maddələri, maşınları və protokolları çıxarın.Primerlərin keyfiyyəti də qRT-PCR-in gücləndirilməsinin effektivliyinə böyük təsir göstərir.Nəticələrin düzgünlüyünü təmin etmək üçün həm nisbi flüoresans kəmiyyəti, həm də mütləq flüoresans kəmiyyəti primerlərin gücləndirmə effektivliyini aşkar etməlidir.Effektiv qRT-PCR gücləndirmə səmərəliliyinin 85% ilə 115% arasında olduğu qəbul edilir.İki üsul var:
1. Standart əyri metodu:
a.cDNA-nı qarışdırın
b.Gradient seyreltmə
c.qPCR
d.Gücləndirmə səmərəliliyini hesablamaq üçün xətti reqressiya tənliyi
2. LinRegPCR
LinRegPCR SYBR Green və ya oxşar kimyaya əsaslanan kəmiyyət PCR (qPCR) məlumatı da adlandırılan real vaxt rejimində RT-PCR Datasının təhlili üçün proqramdır.Proqram qeyri-əsas korrektə edilmiş məlumatlardan istifadə edir, hər bir nümunə üzrə ayrı-ayrılıqda baza korreksiyasını həyata keçirir, xəttin pəncərəsini müəyyən edir və sonra PCR məlumat dəsti vasitəsilə düz xəttə uyğunlaşdırmaq üçün xətti reqressiya təhlilindən istifadə edir.Bu xəttin yamacından hər bir fərdi nümunənin PCR effektivliyi hesablanır.Hər amplikon üçün orta PCR səmərəliliyi və hər nümunə üçün Ct dəyəri ixtiyari flüoresan vahidləri ilə ifadə edilən nümunə üzrə başlanğıc konsentrasiyanı hesablamaq üçün istifadə olunur.Məlumatların daxil edilməsi və çıxışı Excel cədvəli vasitəsilə həyata keçirilir.Yalnız nümunə
qarışdırma tələb olunur, gradient yoxdur
addımlar tələb olunur:(Nümunə olaraq Bole CFX96-nı götürün, aydın ABI ilə tamamilə maşın deyil)
təcrübə:standart qPCR təcrübəsidir.
qPCR məlumat çıxışı:LinRegPCR çıxış fayllarının iki formasını tanıya bilər: RDML və ya kəmiyyətləndirmə Gücləndirmə nəticəsi.Əslində, bu, maşın tərəfindən dövr sayının və flüoresan siqnalının real vaxt aşkarlama dəyəridir və gücləndirmə xətti seqment səmərəliliyinin flüoresan dəyişmə dəyərini təhlil etməklə əldə edilir.
Məlumat seçimi: Teorik olaraq, RDML dəyəri istifadə edilə bilən olmalıdır.Təxmin edilir ki, kompüterimin problemi proqram təminatının RDML-i tanıya bilməməsidir, ona görə də məndə orijinal məlumat kimi excel çıxış dəyəri var.Əvvəlcə məlumatların kobud skrininqini həyata keçirmək tövsiyə olunur, məsələn, nümunələrin əlavə edilməməsi və s. Çıxış məlumatlarında nöqtələr silinə bilər (əlbəttə ki, onları silə bilməzsiniz, LinRegPCR sonrakı mərhələdə bu nöqtələrə məhəl qoymayacaq)

Şəkil 5 qPCR məlumatlarının ixracı

Fig6 namizəd nümunələrinin seçimi

Məlumat daxiletmə:Kvalifikasiya gücləndirmə nəticələrini açın.xls, → LinRegPCR-i açın → faylı → excel-dən oxuyun → Şəkil 7-də göstərildiyi kimi parametrləri seçin → OK → əsas xətləri müəyyənləşdirin üzərinə klikləyin

linRegPCR məlumat girişinin Şəkil 7 addımları

Nəticə:Təkrar yoxdursa, qruplaşma tələb olunmur.Təkrar varsa, qruplaşdırma nümunə qruplaşmasında redaktə edilə bilər və genin adı identifikatora daxil edilir və sonra eyni gen avtomatik olaraq qruplaşdırılacaq.Nəhayət, faylın üzərinə klikləyin, excel-i ixrac edin və nəticələrə baxın.Hər bir quyunun gücləndirmə səmərəliliyi və R2 nəticələri göstərilir.İkincisi, qruplara bölünsəniz, düzəldilmiş orta gücləndirmə səmərəliliyi göstəriləcəkdir.Hər bir primerin gücləndirmə səmərəliliyinin 85% ilə 115% arasında olduğundan əmin olun.Çox böyük və ya çox kiçikdirsə, bu, primerin gücləndirmə səmərəliliyinin zəif olduğunu göstərir.

Şəkil 8 Nəticə və məlumat çıxışı

Eksperimental proses:
RNT keyfiyyət tələbləri:
Saflıq:1.72.0 izotiosiyanat qalığının ola biləcəyini göstərir.Təmiz nuklein turşusu A260/A230 2 civarında olmalıdır. 230 nm-də güclü udma varsa, bu, fenat ionları kimi üzvi birləşmələrin olduğunu göstərir.Bundan əlavə, 1,5% agaroz gel elektroforezi ilə aşkar edilə bilər.Markeri göstərin, çünki ssRNA-da denaturasiya yoxdur və molekulyar çəki loqarifmi xətti əlaqəyə malik deyil və molekulyar çəki düzgün ifadə edilə bilməz.Konsentrasiya: nəzəriyox100ng/ul-dən az, konsentrasiya çox aşağıdırsa, təmizlik ümumiyyətlə aşağıdır, hündür deyil

Fig9 RNT gel

Bundan əlavə, əgər nümunə qiymətlidirsə və RNT konsentrasiyası yüksəkdirsə, ekstraksiyadan sonra onu alikotlaşdırmaq və əks transkripsiya üçün RNT-ni 100-300 ng/ul yekun konsentrasiyasına qədər seyreltmək tövsiyə olunur.Inəks transkripsiya prosesi, mRNT transkripsiya edildikdə, əks transkripsiya üçün polyA quyruqlarına xüsusi olaraq bağlana bilən oliqo (dt) primerləri, lncRNA və circRNA isə ümumi RNT-nin əks transkripsiyası üçün təsadüfi heksamer (Təsadüfi 6 mer) primerlərindən istifadə edir.İndi bir çox şirkətlər xüsusi tullantı dəstlərini işə salıblar.Kök-döşəmə metodu üçün quyruq metodu daha rahat, yüksək məhsuldarlıq və reagent qənaətcildir, lakin eyni ailənin miRNA-larının fərqləndirilməsinin təsiri kök döngə metodu qədər yaxşı olmamalıdır.Hər bir əks transkripsiya dəstində genə xas primerlərin (gövdə döngələrinin) konsentrasiyası üçün tələblər var.miRNA üçün istifadə olunan daxili istinad U6-dır.Kök-loop inversiya prosesində, U6-nın bir borusu ayrıca tərsinə çevrilməlidir və U6-nın ön və arxa primerləri birbaşa əlavə edilməlidir.Həm circRNA, həm də lncRNA HKG-ləri daxili istinad kimi istifadə edə bilər.IncDNA aşkarlanması,
RNT ilə bağlı problem yoxdursa, cDNA da yaxşı olmalıdır.Bununla belə, əgər eksperimentin mükəmməlliyi təqib edilirsə, gDNT-ni CD-lərdən ayırd edə bilən daxili istinad genindən (Referans gen, RG) istifadə etmək ən yaxşısıdır.Ümumiyyətlə, RG ev təsərrüfatı genidir., HKG) Şəkil 10-da göstərildiyi kimi;O zaman mən soya saxlama zülalını hazırlayırdım və daxili istinad olaraq intronlar olan aktin7-dən istifadə edirdim.Bu primerin gDNT-də gücləndirilmiş fraqmentinin ölçüsü 452bp idi və cDNA şablon kimi istifadə olunarsa, 142bp idi.Sonra test nəticələri cDNA-nın bir hissəsinin həqiqətən gDNT ilə çirkləndiyini və əks transkripsiya nəticəsində heç bir problem olmadığını sübut etdi və PCR üçün şablon kimi istifadə edilə bilər.Agaroz gel elektroforezini birbaşa cDNA ilə aparmaq faydasızdır və bu, diffuz bir zolaqdır, bu inandırıcı deyil.

Şəkil 10 cDNA aşkarlanması

qPCR şərtlərinin müəyyən edilməsiəsasən tm dəyərinin addımında dəstin protokoluna görə ümumiyyətlə heç bir problem yoxdur.Əgər bəzi primerlər primer dizaynı zamanı yaxşı tərtib olunmayıbsa, nəticədə tm dəyəri ilə nəzəri 60°C arasında böyük fərq yaranırsa, cDNA-nın nümunələr qarışdırıldıqdan sonra primerlərlə gradient PCR aparması və TM dəyəri kimi zolaqlar olmadan temperatur təyin etməməyə çalışması tövsiyə olunur.

Məlumatların təhlili

Adi nisbi floresan kəmiyyət PCR emal üsulu əsasən 2-ə uyğundur-ΔΔCT.Məlumat emalı şablonu.

Əlaqədar məhsullar:

Real Time PCR Easy^TM – Təqman

Real Time PCR Easy^TM -SYBR GREEN I

RT Easy I (Birinci zəncir cDNA sintezi üçün Master Premiks)

RT Easy II (qPCR üçün ilk zəncir cDNA sintezi üçün Master Premiks)