Hər kəs qRT-PCR eksperimentinin prinsipi, primer dizaynı, nəticələrin interpretasiyası və s.-dən danışır, amma məncə qRT-PCR-nin eksperimental əməliyyatını sizinlə bölüşməliyəm.Bu, kiçikdir, amma nəticə ilə bağlıdır.
qRT-PCR etməzdən əvvəl öz RNT və əməliyyat üsullarımızı aydın şəkildə başa düşməliyik.Axı bizim səylərimiz sadəcə məşq etməkdənsə, nəticə əldə etməyə yönəlib.Beləliklə, qRT-PCR etməzdən əvvəl aşağıdakı məsələləri müəyyən etməliyik (bunlardan bəziləri yalnız SYBR üçün tətbiq olunur).
1 RNT-nin pozulmadığına əminsinizmi?
NanoDrop 2000 yalnız RNT-nin konsentrasiyasını və saflığını aşkar edə bilir, lakin RNT-nin bütövlüyünü aşkar edə bilmir.
RNT (RNT Intesity Number) dəyəri Agilent 2100 Bioanalyzer sistemi tərəfindən aşkar edilən RNT-nin bütövlüyünü əks etdirə bilər.
Şək. Müxtəlif RNT nümunələri (eukariotlar) üçün RIN dəyərlərinin sxematik diaqramı
Bununla belə, laboratoriyalarda ümumiyyətlə Agilent 2100 Bioanalyzer yoxdur.Bu halda biz formaldehid gel vasitəsilə aşkarlaya bilərik, lakin RNT-nin ümumi miqdarına tələb yüksəkdir, ona görə də ən sürətli üsul adi gel elektroforezindən istifadə etməkdir.Nüvəsiz mühitdə olmaq tələb olunur, ona görə də elektroforez çənini, sol butulkasını, gel braketini və darağı DEPC suyu ilə yaxalamaq lazımdır.Agaroza həmçinin nukleazsızdır (təzə açıldığı müddətcə) və Yükləmə Buferi 1,2% gellə mümkün qədər təzə açılmalıdır.
Qeyd edək ki, gel tamamilə həll edilməlidir, əks halda şəkildəki nümunə 9-da göstərildiyi kimi qeyri-homogen zolaqlara səbəb olacaqdır.Gərginlik çox yüksəkdirsə və ya çox uzun müddət işləyirsə, istilik əmələ gəlir və RNT deqradasiyasına səbəb olur, ona görə də gərginlik və vaxta əsaslı şəkildə nəzarət edilməlidir.Bundan əlavə, gel işləməsi nümunədə DNT qalığının olub-olmadığını daha da müəyyən edə bilər və paylama quyusunda çoxlu sayda saxlanılan zolaqların olub-olmadığını müşahidə edə bilər.
Şəkil.RNT-nin gel elektroforezinin aşkarlanması
2 cDNA-nın konsentrasiyasına əminsinizmi?
Laboratoriyada böyük qardaşların təcrübəsi ondan ibarətdir ki, hər bir inversiya ilə əldə edilən 20 ul sisteminin cDNT-si birbaşa olaraq 20X, post-doktora bacıları isə 10X seyreltilir.Mən adətən vəziyyətdən asılıdır.Hər bir insanın qeyd etdiyi RNT-nin keyfiyyəti fərqli olduğu üçün geriyə çevrilmə səviyyəsi də fərqlidir və geri çevirmə texnologiyası sabit olmaya bilər.
Beləliklə, hər dəfə əks cDNA əldə etdikdə, əvvəlcə onu təxminən 3 dəfə sulandıracağam və sonra RT-PCR etmək üçün ev təsərrüfatı genindən istifadə edəcəyəm, dövrlərin sayı ümumiyyətlə 25 dövrdür, xüsusi konsentrasiyanı müəyyən etmək və sonra son seyreltmə faktorunu təyin etmək.
3 Astarlarınızın istifadəsinin asan olduğuna əminsinizmi?
O, qRT-PCR-nin ərimə əyrisini keçə bilər, lakin bu, hələ də pula başa gəlir.Çox pulu olmayan laboratoriyalar üçün, çoxlu primerlər əldə etdikdə, adi RT-PCR-dən istifadə edərək, onun tək bant olub-olmadığını və primerlərin spesifikliyini müəyyən edə bilərlər.Laboratoriyada pul çatışmazlığı yoxdursa, bütün primerlərin spesifikliyi ərimə əyrisi vasitəsilə bir dəfə müəyyən edilə bilər.
4 Təcrübə şərtlərinizin uyğun olduğuna əminsinizmi?
SYBR güclü işıqdan qorunmalıdır, ona görə də SYBR reagentini əlavə edərkən yuxarı işığı söndürməyə çalışın və onu tamamlamaq üçün yalnız zəif işıqdan istifadə etməlisiniz.
SYBR-ni 4°C temperaturda saxlayın.İstifadə edərkən, köpüklənməməsi üçün yaxşıca qarışdırmaq üçün yumşaq bir şəkildə yuxarı və aşağı çevirin və güclü burulğan etməyin.
Bəzi kiçik bacılar nümunələri qarışdırmaqdan qorxaraq PCR lövhəsində işarələr çəkməyi xoşlayırlar, bu səhvdir.Markerləriniz flüoresan siqnalların toplanmasına çox təsir göstərdiyinə görə, ümumiyyətlə, aşağıda göstərildiyi kimi gənclərə yaddaşa kömək etmək üçün eksperimental noutbuklardan istifadə etməyi tövsiyə edirəm.
Şəkil.qRT-PCR nümunə yükləmə diaqramı
5 Düzgün etdiyinizə əminsiniz?
Əlcək taxdığınızdan, əlcək taxdığınızdan, əlcək taxdığınızdan və üç dəfə vacib şeyləri söylədiyinizdən əmin olun.
SYBR-nin işığa məruz qalmasını azaltmaq üçün şəxsən aşağıdakı şəkildə göstərildiyi kimi əvvəlcə şablon əlavə etməyi xoşlayıram.Təcrübəyə görə, az miqdarda şablonun əlavə edilməsi, seçmə səhvlərinə səbəb ola bilər.Buna görə də, az miqdarda şablon əlavə etməklə yaranan xətanı minimuma endirmək üçün mən adətən nümunəni yenidən ikiqat artırıram və əlavə edilən H2O2 miqdarını azaltmaq üçün nümunəni əlavə edərkən miqdarı iki dəfə artırıram.
Şəkil.qRT-PCR yüklənməsinin sxematik diaqramı
Sonra qRT-PCR sistemini aşağıdakı kimi konfiqurasiya edin.
Şəkil.qRT-PCR sisteminin hazırlanması diaqramı
QEYD: Konfiqurasiya prosesi buz üzərində aparılmalıdır.
Nümunəni əlavə etdikdən sonra şəffaf sızdırmazlıq filmini yapışdırın.Şəffaf sızdırmazlıq filminin səthinə əllərinizlə toxunmamağa çalışın, sadəcə filmin hər iki tərəfindəki boşluqdan işləyin.Çünki barmaq izləri flüoresan siqnalların toplanmasına da təsir edə bilər.Sonra nümunənin divardan asılmasının qarşısını almaq üçün aşağı sürətlə 10 s sürətlə sentrifuqa etmək üçün sentrifuqadan istifadə edin.
Əlaqədar məhsullar:
Göndərmə vaxtı: 28 aprel 2023-cü il
