COVID-19 Ağır Kəskin Tənəffüs Sindromu Koronavirus Tip 2-nin yaratdığı yoluxucu xəstəlikdir. İnsan yoluxduqda ən çox görülən simptomlara qızdırma, öskürək və nəfəs darlığı daxildir.

Sınaq üçün istifadə olunan nümunələr nazofarengeal tamponlar və ya orofaringeal tamponlarla toplana bilər.

PCR nədir?

Koronavirusun aşkarlanmasının standart üsulu polimeraza zəncirvari reaksiya, PCR-dir.Bu, molekulyar biologiyada geniş istifadə olunan bir üsuldur.O, milyonlarla milyardlarla spesifik DNT fraqmentini sürətlə kopyalaya bilir.

Yeni koronavirus çox uzun tək zəncirli RNT genomuna malikdir.Bu virusları PCR ilə aşkar etmək üçün RNT molekulları əks transkriptaza ilə onların tamamlayıcı DNT ardıcıllığına çevrilməlidir və sonra yeni sintez edilmiş DNT adətən RT-PCR kimi tanınan standart PCR prosedurları ilə gücləndirilə bilər.

RT-PCR prosesi

RNT çıxarılması

Bu metodu yerinə yetirmək üçün əsasən viral RNT çıxarılmalıdır.Rahat, sürətli və effektiv ayırma üçün müxtəlif RNT təmizləmə dəstlərindən istifadə edilə bilər.

Ticarət dəstindən istifadə edərək virus RNT-ni çıxarmaq üçün əvvəlcə nümunəni mikrosentrifuqa borusuna əlavə edin və sonra onu liziz tamponu ilə qarışdırın.Bu tampon yüksək dərəcədə denatürləşdirilmişdir və adətən fenol və guanidin izotiosiyanatdan ibarətdir.Bundan əlavə, bütöv viral RNT-nin təcrid olunmasını təmin etmək üçün RNaz inhibitorları adətən liziz tamponunda mövcuddur.

Lizis buferini əlavə etdikdən sonra qarışdırma borusunu nəbzlə burulğan edin və otaq temperaturunda inkubasiya edin.Daha sonra virus lizis tamponu tərəfindən təmin edilən yüksək denaturasiya şəraitində parçalanır.

Nümunə parçalandıqdan sonra təmizləmə proseduru üçün bir sentrifuqa borusu istifadə olunur.Nümunə sentrifuqa borusuna yüklənir və sonra sentrifuqalanır.

Bu prosedur stasionar fazanın silisium gel matrisindən ibarət olduğu bərk fazalı ekstraksiya üsuludur.

Optimal duz və pH şəraitində RNT molekulları silisium membranına bağlanır.

Eyni zamanda, protein və digər çirkləndiricilər çıxarılır.

Santrifüjdən sonra sentrifuqa borusunu təmiz toplama borusuna qoyun, filtratı atın və sonra yuyucu bufer əlavə edin.

Yuma tamponunun membrandan keçməsi üçün borunu yenidən sentrifuqaya qoyun.Bu, bütün qalan çirkləri membrandan çıxaracaq, yalnız silisium gelə bağlı RNT qalacaq.

Nümunə yuyulduqdan sonra borunu təmiz mikrosentrifuqa borusuna qoyun və elüsyon tamponunu əlavə edin.

Sonra elüsyon tamponunu membrandan zorla keçirmək üçün sentrifuqa edilir.Elüsyon tamponu spin sütunundan viral RNT-ni çıxarır və zülallardan, inhibitorlardan və digər çirkləndiricilərdən təmizlənmiş RNT əldə edir.

ADDIM 2

Qarışıq konsentrat

Viral RNT-nin çıxarılmasından sonra növbəti addım reaksiya qarışığının PCR gücləndirilməsi üçün hazırlanmasıdır.Bu mərhələdə konsentrat istifadə olunur.Bu konsentratlı məhlul əvvəlcədən qarışıq, əks transkriptaza, nukleotidlər, irəli primer, əks primer, TaqMan zondu və DNT polimerazadan ibarət əvvəlcədən qarışdırılmış konsentrat məhluldur.

Nəhayət, bu reaksiya qarışığını tamamlamaq üçün RNT şablonu əlavə edilir.Borular impuls burulğanı ilə qarışdırılır və sonra reaksiya qarışığı PCR plitəsinə yüklənir.PCR lövhəsi adətən 96 quyudan ibarətdir və eyni zamanda bir neçə nümunəni təhlil edə bilir.

ADDIM 3

PCR gücləndirilməsi

Sonra, plitəni əslində termal dövran edən PCR maşınına qoyun.

Real vaxt rejimində RT-PCR, RdrRP geni, E geni və N genindəki hədəf ardıcıllığı gücləndirərək 2019-cu ilin yeni koronavirusunu aşkar etmək üçün istifadə olunur.Hədəf genin seçimi primer və zond ardıcıllığından asılıdır.

RT-PCR-nin ilk addımı tərs transkripsiyadır.Tamamlayıcı DNT-nin birinci zəncirinin sintezi həyata keçirilir ki, bu da virus RNT genomunun tamamlayıcı hissəsinə bağlanan PZR tərs primer tərəfindən başlanır.Sonra tərs transkriptaza virus RNT-yə tamamlayıcı DNT sintez etmək üçün primerin 3′ ucuna DNT nukleotidlərini əlavə edir.Bu addımın temperaturu və müddəti istifadə olunan primerlərdən, hədəf RNT-dən və əks transkriptazadan asılıdır.

Sonra ilkin denaturasiya mərhələsi tətbiq edilir ki, bu da RNT-DNT hibridinin denatürasiyası ilə nəticələnir.Bu addım DNT polimerazını aktivləşdirmək üçün lazımdır.Eyni zamanda, əks transkriptaza təsirsiz hala gəlir.

PCR bir sıra termal dövrələrdən ibarətdir.Hər bir dövr denatürasiya, tavlama və uzatma mərhələlərindən ibarətdir.

Denatürasiya mərhələsi reaksiya kamerasının 95 dərəcə Selsiyə qədər qızdırılmasını və ondan ikiqat zəncirli DNT şablonunun denatürasiyası üçün istifadə edilməsini nəzərdə tutur.

Növbəti addımda reaksiya temperaturu 58 dərəcə Selsiyə endirilir ki, bu da irəli primerin tək zəncirli DNT şablonunun tamamlayıcı hissəsinə bağlanmasına imkan verir.Yuyulma temperaturu birbaşa astarın uzunluğundan və tərkibindən asılıdır.

Uzatma mərhələsində DNT polimeraza DNT şablon zəncirini tamamlayan yeni DNT zəncirini sintez edir.Reaksiya qarışığından 5′-dən 3′istiqamətdə şablona tamamlayıcı sərbəst nüvələr əlavə etməklə.Bu mərhələnin temperaturu istifadə olunan DNT polimerazından asılıdır.

Birinci dövrədən sonra cüt zəncirli DNT hədəfi əldə edilir.

Sonra ikinci dövrəyə daxil olun.İki zəncirli DNT denatürasiya edilir ki, iki tək zəncirli DNT molekulu əmələ gəlir.

Növbəti mərhələdə reaksiya temperaturu aşağı salınır, primerlər hər bir tək zəncirli DNT şablonuna tavlanır və Taq-man zondu hədəf DNT-nin tamamlayıcı hissəsinə bağlanır.

TaqMan zondu oliqonukleotid zondunun 5′ ucuna kovalent şəkildə bağlanmış flüorofordan ibarətdir.Siklatorun işıq mənbəyi ilə həyəcanlandıqda, flüorofor flüoresans yayır.Bundan əlavə, prob 3′ ucunda söndürücüdən ibarətdir.Reportyor geninin söndürücüyə yaxınlığı flüoresansın aşkarlanmasına mane olur.

Uzatma mərhələsində DNT polimeraza yeni bir zəncir sintez edir.Polimeraza TaqMan zonduna çatdıqda, onun endogen 5′nükleaz aktivliyi boyanı söndürücüdən ayıraraq zonddan ayrılır.

PCR-nin hər dövrü ilə daha çox boya molekulu ayrılır, nəticədə sintez olunan amplikonların sayına mütənasib olaraq flüoresans intensivliyi artır.

Bu üsul nümunədə mövcud olan ardıcıllığın sayını təxmin etməyə imkan verir.Hər dövrədə ikiqat zəncirli DNT fraqmentlərinin sayı ikiqat artır.Buna görə də, PCR çox kiçik nümunələri təhlil etmək üçün istifadə edilə bilər.

Floresan siqnalının ölçülməsi üçün volfram halogen lampa, həyəcan filtri, reflektor, linza, emissiya filtri və şarjla birləşdirilmiş cihazdan istifadə olunan CCD kamera.

ADDIM 4 Aşkarlayın

Floresan siqnalının ölçülməsi üçün volfram halogen lampa, həyəcan filtri, reflektor, linza, emissiya filtri və şarjla birləşdirilmiş cihazdan istifadə olunan CCD kamera.

Lampadan süzülmüş işıq reflektor tərəfindən əks olunur, kondensator lensindən keçir və hər bir çuxurun mərkəzinə yönəldilir.Sonra çuxurdan yayılan flüoresans güzgüdən əks olunur, emissiya filtrindən keçir və CCD kamera tərəfindən aşkar edilir.Hər bir PCR dövründə, özünü həyəcanlandıran flüorofor işığı CCD tərəfindən aşkar edilə bilər.

O, çəkilmiş işığı rəqəmsal məlumatlara çevirir.Bu üsul real vaxtda PCR adlanır və bu, PCR reaksiyasının gedişatını real vaxt rejimində izləməyə imkan verir.