PCR (polimeraza zəncirvari reaksiya) 30 ildən çox tarixə malik olan in vitro DNT gücləndirmə texnologiyalarından biridir.

PCR texnologiyası 1983-cü ildə Cetusdan, ABŞ-dan Kary Mullis tərəfindən irəli sürülüb. Mullis 1985-ci ildə PCR patenti üçün müraciət etdi və həmin ildə Elm üzrə ilk PCR akademik məqaləsini nəşr etdi.Mullis işinə görə 1993-cü ildə kimya üzrə Nobel mükafatına layiq görülüb.

PCR-nin əsas prinsipləri

PCR hədəf DNT fraqmentlərini bir milyon dəfədən çox gücləndirə bilər.Prinsip əsas zəncir DNT-ni şablon kimi istifadə edərək, genişlənmə üçün başlanğıc nöqtəsi kimi spesifik primerdən istifadə edərək DNT polimerazın katalizindədir.Denatürasiya, tavlama və uzatma kimi mərhələlərlə in vitro təkrarlanır.Ana zəncir şablonu DNT-ni tamamlayan qız zəncirinin DNT prosesi.

Standart PCR prosesi üç mərhələyə bölünür:

1.Denaturasiya: DNT cüt zəncirlərini ayırmaq üçün yüksək temperaturdan istifadə edin.DNT cüt zəncirləri arasındakı hidrogen bağı yüksək temperaturda (93-98 ℃) qırılır.

2.Annealing: İki zəncirli DNT ayrıldıqdan sonra, primerin tək zəncirli DNT-yə bağlana bilməsi üçün temperaturu aşağı salın.

3. Uzatma: DNT polimeraza temperaturu aşağı saldıqda bağlanan primerlərdən DNT zəncirləri boyunca tamamlayıcı zəncirləri sintez etməyə başlayır.Uzatma tamamlandıqda, bir dövr tamamlanır və DNT fraqmentlərinin sayı ikiqat artır

Bu üç addımı 25-35 dəfə təkrarlayan DNT fraqmentlərinin sayı eksponent olaraq artacaq.

PCR-in ixtiraçılığı ondan ibarətdir ki, müxtəlif primerlər müxtəlif hədəf genlər üçün tərtib oluna bilər, beləliklə hədəf gen fraqmentləri qısa müddət ərzində gücləndirilə bilər.

İndiyə qədər PCR üç kateqoriyaya bölünə bilər, yəni adi PCR, flüoresan kəmiyyət PCR və rəqəmsal PCR.

Adi PCR-nin ilk nəsli

Hədəf geni gücləndirmək üçün adi PCR gücləndirmə alətindən istifadə edin və sonra məhsulu aşkar etmək üçün agaroz gel elektroforezindən istifadə edin, yalnız keyfiyyət analizi edilə bilər.

Birinci nəsil PCR-nin əsas çatışmazlıqları:

1.Qeyri-spesifik gücləndirmə və yanlış müsbət nəticələrə meyllidir.

2. Aşkarlama çox vaxt aparır və əməliyyat çətin olur.

3. Yalnız keyfiyyət testi edilə bilər

İkinci nəsil Real-Time PCR

Real-Time PCR, həmçinin qPCR kimi tanınan, reaksiya sisteminin gedişatını göstərə bilən flüoresan zondlardan istifadə edir və flüoresan siqnalların toplanması vasitəsilə gücləndirilmiş məhsulların yığılmasına nəzarət edir və flüoresan əyrisi vasitəsilə nəticələri mühakimə edir.Cq dəyərinin və standart əyrinin köməyi ilə kəmiyyətlə müəyyən edilə bilər.

qPCR texnologiyası qapalı sistemdə həyata keçirildiyi üçün çirklənmə ehtimalı azalır və kəmiyyət aşkarlanması üçün flüoresan siqnalı izlənilə bilir, ona görə də o, klinik praktikada ən geniş istifadə olunur və PCR-də dominant texnologiyaya çevrilib.

Real vaxt rejimində flüoresan kəmiyyət PCR-də istifadə olunan flüoresan maddələr aşağıdakılara bölünə bilər: TaqMan flüoresan zondu, molekulyar mayaklar və flüoresan boya.

1) TaqMan flüoresan zondu:

PCR gücləndirilməsi zamanı bir cüt primer əlavə edilərkən xüsusi bir flüoresan zond əlavə edilir.Zond bir oliqonukleotiddir və hər iki ucu müxbir flüoresan qrupu və söndürücü flüoresan qrupu ilə etiketlənir.

Zond bütöv olduqda, reportyor qrupu tərəfindən buraxılan flüoresan siqnal söndürmə qrupu tərəfindən udulur;PCR amplifikasiyası zamanı Taq fermentinin 5′-3′ eksonükleaz aktivliyi probu parçalayır və deqradasiya edir, bu da məruzəçi flüoresan qrupu və söndürücü edir. siqnal tamamilə PCR məhsulunun formalaşması ilə sinxronlaşdırılır.

2) SYBR floresan boyası:

PCR reaksiya sistemində artıq SYBR floresan boyası əlavə edilir.SYBR flüoresan boyası qeyri-spesifik olaraq DNT cüt zəncirinə daxil edildikdən sonra flüoresan siqnal verir.Zəncirə daxil olmayan SYBR boya molekulu heç bir flüoresan siqnal yaymayacaq və bununla da flüoresan siqnalını təmin edəcək. PCR məhsullarının artması PCR məhsullarının artması ilə tamamilə sinxronlaşdırılır.SYBR yalnız ikiqat zəncirli DNT-yə bağlanır, buna görə də ərimə əyrisi PCR reaksiyasının spesifik olub olmadığını müəyyən etmək üçün istifadə edilə bilər.

3) Molekulyar mayak:

Bu, 5 və 3 uclarında təxminən 8 əsasdan ibarət saç sancağı quruluşunu əmələ gətirən, gövdəli ikiqat etiketli oliqonukleotid zondudur.Hər iki ucundakı nuklein turşusu ardıcıllığı bir-birini tamamlayan şəkildə qoşalaşır, bu da flüoresan qrupunun və söndürmə qrupunun sıx olmasına səbəb olur.Bağlayın, heç bir flüoresan istehsal edilməyəcək.

PCR məhsulu yaradıldıqdan sonra yumşalma prosesi zamanı molekulyar mayakın orta hissəsi xüsusi DNT ardıcıllığı ilə qoşalaşır və flüoresan gen söndürücü gendən flüoresans əmələ gətirmək üçün ayrılır.

İkinci nəsil PCR-nin əsas çatışmazlıqları:

Həssaslıq hələ də yoxdur və aşağı nüsxəli nümunələrin aşkarlanması qeyri-dəqiqdir.

Fon dəyərinin təsiri var və nəticə müdaxiləyə həssasdır.

Reaksiya sistemində PCR inhibitorları olduqda, aşkarlama nəticələri müdaxiləyə həssas olur.

Üçüncü nəsil rəqəmsal PCR

Rəqəmsal PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) son nöqtənin aşkarlanması vasitəsilə hədəf ardıcıllığının surət nömrəsini hesablayır və daxili nəzarətlərdən və standart əyrilərdən istifadə etmədən dəqiq mütləq kəmiyyət aşkarlamasını həyata keçirə bilər.

Rəqəmsal PCR son nöqtənin aşkarlanmasından istifadə edir və Ct dəyərindən (dövrün həddi) asılı deyil, buna görə də rəqəmsal PCR reaksiyası gücləndirmə səmərəliliyindən daha az təsirlənir və PCR reaksiya inhibitorlarına qarşı dözümlülük yüksək dəqiqlik və təkrar istehsal qabiliyyəti ilə yaxşılaşdırılır.

Yüksək həssaslıq və yüksək dəqiqlik xüsusiyyətlərinə görə, PCR reaksiya inhibitorları tərəfindən asanlıqla müdaxilə edilmir və tədqiqat və tətbiq qaynar nöqtəsinə çevrilmiş standart məhsullar olmadan əsl mütləq kəmiyyətə nail ola bilir.

Reaksiya vahidinin müxtəlif formalarına görə onu üç əsas növə bölmək olar: mikrofluidik, çip və damcı sistemləri.

1) Mikrofluidik rəqəmsal PCR, mdPCR:

Mikrofluidik texnologiya əsasında DNT şablonu ayrılır.Mikrofluidik texnologiya nümunənin nano təkmilləşdirməsini və ya daha kiçik damcıların əmələ gəlməsini həyata keçirə bilər, lakin damcıların xüsusi adsorbsiya metoduna ehtiyacı var və sonra PCR reaksiya sistemi ilə birləşdirilməlidir.mdPCR tədricən digər üsullarla dəyişdirilərək qəbul edilmişdir.

2) Damlacıq əsaslı rəqəmsal PCR, ddPCR:

Nümunəni damcılara emal etmək üçün yağda su damlacıqlarının yaradılması texnologiyasından istifadə edin və tərkibində nuklein turşusu molekulları olan reaksiya sistemini minlərlə nanoölçülü damlacıqlara bölün, onların hər birində aşkar ediləcək nuklein turşusu hədəf molekulu yoxdur və ya yoxlanılacaq birdən bir neçə nuklein turşusu hədəf molekulunu ehtiva edir.

3) Çip əsaslı rəqəmsal PCR, cdPCR:

Silikon vaflilər və ya kvars şüşələri üzərində çoxlu mikrotubu və mikro boşluqları həkk etmək və müxtəlif nəzarət klapanları vasitəsilə məhlulun axınına nəzarət etmək üçün inteqrasiya olunmuş maye yolu texnologiyasından istifadə edin və mütləq kəmiyyətə nail olmaq üçün nümunə mayesini rəqəmsal PCR Reaksiyasının reaksiya quyularına eyni ölçülü nanometrlərə bölün.

Üçüncü nəsil PCR-nin əsas çatışmazlıqları:

Avadanlıqlar və reagentlər bahadır.

Şablonun keyfiyyət tələbləri yüksəkdir.Şablon kəmiyyəti mikrosistem kəmiyyətindən artıq olarsa, kəmiyyəti müəyyən etmək mümkün olmayacaq, çox kiçik olarsa, kəmiyyət dəqiqliyi azalacaq.

Qeyri-spesifik gücləndirmə olduqda da yanlış pozitivlər yarana bilər.