PCR, çoxsaylı PCR, Yerində PCR, Əks PCR, RT-PCR, qPCR（1）–PCR

Müxtəlif PCR-lərin konsepsiyalarını, addımlarını və təfərrüatlarını sıralayacağıq

Ⅰ. PCR

PCR olaraq adlandırılan Polimeraza Zəncirvari Reaksiya xüsusi DNT fraqmentlərini böyütmək üçün istifadə edilən molekulyar bioloji texnologiyadır.Bunu in vitroda xüsusi DNT replikasiyası kimi qəbul etmək olar.DNT polimeraza (DNT Polimeraz I) hələ 1955-ci ildə, eksperimental dəyəri və praktikliyi olan E.Coli-nin Klenow Fragmenti isə 1970-ci illərin əvvəllərində doktor H.Klenow tərəfindən kəşf edilmişdir, lakin bu ferment temperatura dözmədiyi üçün yüksək temperatur onu degenerasiya edə bilər, ona görə də polimerazanın degenerasiyası ilə yüksək temperatur reaksiyasına cavab vermir.Bu gün istifadə olunan fermentlər (Taq polimeraza adlanır) 1976-cı ildə Thermus aquaticus, isti bulaq bakteriyasından təcrid edilmişdir. Onun xarakterik xüsusiyyəti yüksək temperatura davamlı olması və ideal ferment olmasıdır, lakin 1980-ci illərdən sonra geniş istifadə olunur.PCR-nin ilkin primitiv prototipinin orijinal konsepsiyası 1971-ci ildə Dr. KJell Kleppe tərəfindən təklif edilən gen təmiri və surətinin çıxarılmasına bənzəyir. O, ilk sadə və qısamüddətli gen nüsxəsini nəşr etdirdi (PZR-nin ilk iki dövrü reaksiyasına bənzər).Bu gün hazırlanmış PCR 1983-cü ildə Dr. Kary B. Mullis tərəfindən hazırlanmışdır. Dr. Mullis həmin il PE şirkətlərinə xidmət etmişdir, ona görə də PE PCR sənayesində xüsusi statusa malikdir.Dr. Mullis 1985-ci ildə Saiki və başqaları ilə əlaqəli ilk məqaləni rəsmi olaraq nəşr etdi. O vaxtdan bəri, PCR-dən istifadə gündə minlərlə mildir və əlaqəli sənədlərin keyfiyyətinin bir çox digər tədqiqat üsullarını xoşagəlməz hala gətirdiyini söyləmək olar.Sonradan, PCR texnologiyası molekulyar biologiya tədqiqatının ən vacib texnologiyasına çevrilərək bioloji elmi tədqiqatlarda və klinik tətbiqlərdə geniş istifadə olunur.Mullis 1993-cü ildə kimya üzrə Nobel mükafatını da qazanıb.

PCRPrinsip

PCR texnologiyasının əsas prinsipi DNT-nin təbii replikasiya prosesinə bənzəyir və onun spesifikliyi hədəf ardıcıllığın hər iki ucunu tamamlayan oliqonukleotid primerindən asılıdır.PCR degenerasiya-tavlama-uzandıran üç əsas reaksiya pilləsindən ibarətdir: ①Şablon DNT-nin degenerasiyası: Şablon DNT müəyyən bir müddət ərzində təxminən 93°C-yə qədər qızdırıldıqdan sonra, şablonun PCR gücləndirilməsi nəticəsində əmələ gələn ikili zəncirli DNT üçün ikili DNT məhlulu, onu sonrakı birləşən DNT-nin astarlanmasına hazırlaya bilər. dairəvi reaksiya.②Şablon DNT və primerin yumşaldılması (birləşməsi): Şablon DNT qızdırıldıqdan və tək zəncirdə degenerasiya edildikdən sonra temperatur təxminən 55°C-ə düşür.Primer və şablon DNT-nin tək zəncirli tamamlayıcı ardıcıllığı.③Praymerin uzadılması: DNT şablonu- primerin bağlanması reaksiya xammalı kimi dNTP olan TaqDNA polimerazanın fəaliyyətinə əsaslanır.Replikasiya prinsipini qoruyun, şablon DNT zəncirini tamamlayan yeni yarı qorunan nüsxə zəncirini sintez edin və təkrar dövr degenerasiya-tavlama-uzatma üç prosesi daha çox “yarı qorunan nüsxə zənciri” əldə edə bilər və bu yeni zəncir yenidən mövcuddur Növbəti dövr üçün şablon olun.Döngəni tamamlamaq üçün 2-4 dəqiqə çəkir, hədəf gen 2-3 saat ərzində bir neçə milyon dəfə gücləndirilə bilər.

StandartPCRReaksiya sistemi

PCR reaksiyasının beş elementi

PCR reaksiyasında iştirak edən əsasən beş növ maddə var, yəni primer, ferment, dNTP, şablon və tampon (Mg2+ tələb olunur).[PCR proseduru]

Standart PCR prosesi üç mərhələyə bölünür

1. DNT degenerasiyası (90°C-96°C): Termal təsir altında iki zəncirli DNT şablonları, hidrogen bağları qırılır, tək zəncirli DNT əmələ gətirir.

2. Qızdırma (25℃ -65℃): Sistem temperaturu azalır, primer yerli ikili zəncir yaratmaq üçün DNT şablonu ilə birləşdirilir.

3. Uzatma (70℃ -75℃): Taq fermentinin təsiri altında (təxminən 72°C, ən yaxşı fəaliyyət), dNTP xammal kimi istifadə olunur, primerin 5′ ucundan → 3′ ucundan uzanır, sintez və şablon bir-birini DNT zəncirini tamamlayır.

Hər bir dövr denatürasiya olunur, tavlanır və uzadılır, DNT tərkibi ikiqat artır.Hazırda gücləndirmə sahəsinin qısa olması səbəbindən, Taq fermentinin aktivliyi optimal olmasa belə, bəzi PZR çox qısa müddətdə təkrarlana bilər, ona görə də iki mərhələyə dəyişdirilə bilər, yəni tavlama və uzatma eyni vaxtda 60°C-65°C-də həyata keçirilə bilər.Qaldırma və soyutma prosesini azaltmaq və cavab sürətini yaxşılaşdırmaq üçün.

PCR Reaksiyasının xüsusiyyətləri

● Yüksək Xüsusiyyət

PCR cavabının spesifik həlledici amilləri bunlardır: ①Printer və şablon DNT-nin spesifik kombinasiyası.②Baza cütləşməsi prinsipi.③TaqDNA polimeraza sintez reaksiyasının loyallığı.④Hədəf genin spesifikliyi və konservativliyi.

Astarların və şablonların düzgün birləşməsi əsasdır.Astarın və şablonun bağlanması və astar zəncirinin uzadılması qələvi baza uyğunluğu prinsipinə əsaslanır.Polimeraz sintez reaksiyalarının loyallığı və reaksiyada şablon və primerin bağlanmasını (birləşməsi) etmək üçün Taq DNT polimerazının yüksək temperatur müqaviməti daha yüksək temperaturda həyata keçirilə bilər.Birləşmənin spesifikliyi çox artır.Klip yüksək dərəcədə düzgünlüyü saxlaya bilir.Yüksək konservativliyə və yüksək konservativliyə malik hədəf genetik bölgəni seçməklə onun spesifikliyi daha yüksək olur.

● Yüksək Həssaslıq

PZR məhsullarının istehsal həcmi indekslə artırılır ki, bu da Picker-in başlanğıc şablonunu genişləndirə bilər (PG=10-12) mikrokontroller səviyyəsini mikroqram səviyyəsinə (μg= -6) yüksəldə bilər.1 milyon hüceyrədən bir hədəf hüceyrə aşkar edilə bilər;virusların aşkarlanmasında, PCR-nin həssaslığı 3 RFU-ya çata bilər (boş ləkələr vahidlər əmələ gətirir);bakteriya elmində minimum aşkarlama dərəcəsi 3 bakteriyadır.

● Sadə və Sürətli

PCR əksi yüksək temperaturlu Taq DNT polimerazından istifadə edir ki, bu da reaksiya məhlulunu bir anda əlavə edir, yəni DNT gücləndirici məhlulda və su vannası qabında degenerasiya-anneal-uzatma reaksiyası.Ümumiyyətlə, gücləndirmə reaksiyası 2-4 saat ərzində tamamlanır.Artırılmış məhsullar ümumiyyətlə elektrik qılıncla təhlil edilir və izotoplardan, radioaktiv çirklənmədən və asan tanıtımdan istifadə etmək məcburiyyətində deyil.

● Nümunənin təmizliyi aşağıdır

Virus və ya bakteriya və mədəniyyət hüceyrələrini ayırmağa ehtiyac yoxdur.DNT xam məhsulları və RNT gücləndiricilər kimi istifadə edilə bilər.DNT amplifikasiyasının aşkarlanması birbaşa qan, bədən mayesi, öskürək yuyan maye, saç, hüceyrələr və canlı toxuma kimi klinik nümunələrdən istifadə etməklə istifadə edilə bilər.

PCRümumi problemlər

● Yanlış mənfi, gücləndirilmiş zolaqlar yoxdur

PCR reaksiyasının əsas mərhələlərinə aşağıdakılar daxildir: ① şablon nuklein turşularının hazırlanması, ② primerlərin keyfiyyəti və spesifikliyi, ③ fermentlərin keyfiyyəti ④ PCR dövrünün şərtləri.Səbəbi tapmaq da yuxarıdakı bağlantılar üçün təhlil edilməli və öyrənilməlidir.

Şablonlar: ① Şablonda müxtəlif zülal var, ② Şablonda Taq enzim inhibitoru var, ③ Şablondakı zülal xaric edilmir, xüsusən də xromosomdakı qrup zülalı.⑤ Deminer nuklein turşusunun degenerasiyası hərtərəfli deyil.Fermentlərin və primerlərin keyfiyyəti yaxşı olduqda, gücləndirmə bandı yoxdur, bu, çox güman ki, nümunələrin həzm müalicəsidir.Şablon nuklein turşusunun çıxarılması prosesində səhv bir şey var, buna görə də effektiv və sabit həzm həllini hazırlamaq üçün onun proseduru düzəldilməlidir və özbaşına dəyişdirilməməlidir.

Fermentin inaktivasiyası: yeni bir ferment və ya həm köhnə, həm də yeni fermentlər ferment aktivliyinin itirildiyini və ya qeyri-kafi olduğunu təhlil etmək üçün birlikdə istifadə edilməlidir, bu da yalançı neqativlərə səbəb olur.Qeyd edək ki, Taq fermenti və ya etidium bromid bəzən unudulur.

Astar: astarın keyfiyyəti, astarın konsentrasiyası və iki primerin konsentrasiyasının simmetrik olub-olmaması.Bu, PCR uğursuzluğunun ümumi səbəbidir və ya artan band ideal deyil və yayılmağa meyllidir.Bəzi partiya nömrələrinin astarlarının keyfiyyətində problemlər var.İki primer yüksək konsentrasiyaya və aşağı konsentrasiyaya malikdir, bu da aşağı effektiv asimmetrik gücləndirməyə səbəb olur.Qarşı tədbirlər bunlardır: ① Vahidləri sintez etmək üçün yaxşı primer seçin.② Astarın konsentrasiyası təkcə OD dəyərindən asılı deyil, həm də agar şəkər gel elektroforezi etmək üçün primerin orijinal mayesinə diqqət yetirir.Bir primer zolaq zonası olmalıdır və iki primerin parlaqlığı ümumiyyətlə uyğun olmalıdır.Kəmər, PCR bu anda uğursuz ola bilər və bu, primer sintez vahidi ilə həll edilməlidir.Bir primer yüksəkdirsə, parlaqlıq aşağıdır və seyreltildikdə konsentrasiyası balanslaşdırılmalıdır.③ Soyuducunun çoxsaylı dondurulması və ya uzun müddət soyuducu hissələrinin astarın xarab olmasına və xarab olmasına səbəb olmasının qarşısını almaq üçün primer ödənilməli və yüksək konsentrasiyada saxlanmalıdır.④ Astarın dizaynı əsassızdır, məsələn, astarın uzunluğu qeyri-kafidir və astarlar arasında di klaster əmələ gəlir.

Mg2+konsentrasiyası: Mg2+ion konsentrasiyası PCR gücləndirilməsinin effektivliyinə böyük təsir göstərir.Həddindən artıq konsentrasiya PCR gücləndirilməsinin əks cinsini azalda bilər.Konsentrasiya çox aşağı olarsa, PCR gücləndirmə çıxışı hətta genişləndirmə zolağı olmadan PCR gücləndirilməsinin uğursuzluğuna səbəb olacaqdır.

Reaksiya həcminin dəyişməsi: PCR gücləndirilməsində istifadə olunan həcm 20ul, 30ul və 50ul və ya 100uL-dir, PCR gücləndirilməsi üçün tətbiqin böyük həcmi elmi tədqiqatın və klinik sınaqların müxtəlif məqsədlərinə uyğun olaraq təyin edilir.20ul kimi kiçik həcmlər etdikdən sonra ölçü hazırlayarkən şnur şərti etmək lazımdır, əks halda uğursuz olar.

Fiziki səbəblər: Transformasiya PCR gücləndirilməsi üçün çox vacibdir.Degenerasiya temperaturu aşağı olarsa, degenerasiya müddəti qısadırsa, yanlış neqativlərdə baş vermə ehtimalı var;çox aşağı tavlama temperaturu qeyri-spesifik gücləndirməyə səbəb ola bilər və xüsusi gücləndirmə səmərəliliyini azalda bilər.PCR gücləndirmə səmərəliliyini azaltmaq üçün primerlərin və şablonların birləşməsinə yüksək təsir göstərir.Bəzən PCR-nin uğursuzluğunun səbəblərindən biri olan uzatma və ya suda həll olunan ocakda dəyişkənliyi, tavlanmanı və uzadılmış temperaturu aşkar etmək üçün standart termometrlərdən istifadə etmək lazımdır.

Hədəf ardıcıllığının variantları: Hədəf ardıcıllığı, mutasiya və ya silinmə baş verərsə, prototip və şablonun birləşməsi birləşdirilərsə və ya hədəf ardıcıllığının olmaması səbəbindən primer və şablon tamamlayıcı ardıcıllığı itirəcək və onun PCR gücləndirilməsi uğurlu olmayacaq.

● Yanlış müsbət

PCR gücləndirmə zolağı hədəf ardıcıllıq zolağına uyğun görünür və bəzən onun zolağı daha səliqəli və yüksək olur.

Primer dizaynı uyğun deyil: seçilmiş gücləndirmə ardıcıllığı və qeyri-məqsədli gücləndirmə ardıcıllığı homologdur, buna görə də PCR gücləndirilməsi zamanı gücləndirilmiş PCR məhsulları qeyri-məqsədli ardıcıllıqlardır.Hədəf ardıcıllığı çox qısadır və ya primer çox qısadır və yalan pozitivliyə meyllidir.Yenidən dizayn etmək lazımdır.

Hədəf ardıcıllığının və ya gücləndirmə məhsullarının çarpaz çirklənməsi: Bu çirklənmənin iki səbəbi var: Birincisi, bütün genomun və ya böyük seqmentlərin çarpaz çirklənməsi, yanlış pozitivlərə səbəb olur.Bu cür yanlış müsbət aşağıdakı üsullarla həll edilə bilər: Hədəf ardıcıllığının nümunə tapançasına daxil olmasının və ya mərkəzdənqaçma borusundan sıçramasının qarşısını almaq üçün əməliyyat zamanı diqqətli və yumşaq olun.Yüksək temperatura tab gətirə bilməyən fermentlər və maddələr istisna olmaqla, bütün reagentlər və ya avadanlıqlar yüksək təzyiqlə dezinfeksiya edilməlidir.Mərkəzdənqaçma boruları və nümunələri eyni vaxtda istifadə edilməlidir.Lazım olduqda, nümunələri əlavə etməzdən əvvəl, mövcud nuklein turşusunu məhv etmək üçün reaksiya borusu və reagent ultrabənövşəyi şüalara məruz qalır.İkincisi, hava çirkliliyində kiçik fraqmentlər.Bu kiçik fraqmentlər hədəf ardıcıllığından daha qısadır, lakin onların müəyyən homologiyası var.Bir-birinə yapışdırıla bilər.Primerləri tamamladıqdan sonra PCR məhsulu genişləndirilə bilər ki, bu da yanlış müsbət istehsala səbəb olacaq.Yuva PCR metodunu azaltmaq və ya aradan qaldırmaq üçün istifadə edilə bilər.

● Qeyri-spesifik gücləndirmə zolağı görünür

PCR gücləndirilməsindən sonra yaranan zolaqlar gözlənilən ölçüyə, yaxud böyük və ya kiçik, yaxud eyni zamanda və ya eyni zamanda, xüsusi gücləndirmə zolaqları və qeyri-spesifik gücləndirmə zolaqları ilə uyğun gəlmir.Qeyri-spesifik zolaqların ortaya çıxması: Birincisi, primerlər hədəf ardıcıllığı tamamlamayan natamamdır və ya primerin polimerləşməsi di klaster əmələ gətirir.İkincisi, MG2+ionlarının konsentrasiyasının çox yüksək olması, yumşalma temperaturunun çox aşağı olması və PCR dövrlərinin sayının əlaqəli olmasıdır.İkincisi, fermentlərin keyfiyyəti və miqdarı.Çox vaxt bəzi mənbələrin fermentləri qeyri-xüsusi zolaqlara meylli olur və digər mənbənin fermentləri əmələ gəlmir.Bəzən fermentlərin qeyri-spesifik gücləndirilməsi də baş verir.Qarşı tədbirlər bunlardır: zərurət yaranarsa, yenidən dizayn edilmiş cəlbedicilər.Fermentin miqdarını azaldın və ya başqa bir mənbənin fermentini əvəz edin.İlkin miqdarını azaldın, şablonların miqdarını müvafiq olaraq artırın və dövrlərin sayını azaldın.Yuvlama temperaturunu düzgün şəkildə artırın və ya iki temperatur nöqtəsi metodundan istifadə edin (93°C degenerasiya, tavlama və təxminən 65°C-də uzanma).

● Ləpələnmiş yedək və ya yaxma lenti görünür

PCR gücləndirilməsi bəzən tətbiq və ya qabıqlı və ya xalçaya bənzər kəmər kimi görünür.Bu səbəbdən fermentlərin həddindən artıq miqdarı və ya fermentin keyfiyyətsizliyi səbəbindən dNTP konsentrasiyası çox yüksək, Mg2 + konsentrasiyası çox yüksək, tavlama temperaturu çox aşağı və dövrlərin sayı çox olur.Qarşı tədbirlər bunlardır: ①Fermentlərin miqdarını azaldın və ya başqa mənbənin fermentini dəyişdirin.②dNTP konsentrasiyasını azaldın ③Mg2+ konsentrasiyasını düzgün şəkildə azaldın.④Şablonların sayını artırın və dövrlərin sayını azaldın.

Əlaqədar məhsullar

PCR Heroᵀᴹ (Boya ilə)

◮ Daha yüksək dəqiqlik: adi Taq fermentindən 6 dəfə;

◮ Daha sürətli gücləndirmə sürəti

◮ Daha çox şablon uyğunlaşması

◮ Daha yüksək gücləndirmə səmərəliliyi

◮ Ekoloji dözümlülük daha güclüdür: 90%-dən çox aktivliyi saxlayaraq, bir həftə ərzində 37°C-də yerləşdirilir;

◮ 5'→3' DNT polimeraza aktivliyinə və 5'→3' ekzonükleaza aktivliyinə malikdir, 3'→5' ekzonükleaz aktivliyi yoxdur.

PCR Easyᵀᴹ (Boya ilə)

Unikal reaksiya sistemi və yüksək effektiv Taq DNT Polimeraz PCR reaksiyasının daha yüksək gücləndirmə effektivliyinə, spesifikliyinə və həssaslığına malik olmasını təmin edir.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Bir Addım)-SYBR Green I

◮ Bir addımlı dəst eyni boruda əks transkripsiya və qPCR iki reaksiya verir, yalnız şablon RNT, xüsusi PCR primerləri və RNase-Free ddH əlavə etmək lazımdır.₂O.

◮ Dəst viral RNT və ya iz RNT-ni tez və effektiv şəkildə kəmiyyətcə təhlil edə bilər.

◮ Dəstə unikal Foregene əks transkripsiya reagentindən və reaksiyanın gücləndirilməsinin effektivliyini və spesifikliyini effektiv şəkildə yaxşılaşdırmaq üçün unikal reaksiya sistemi ilə birlikdə Foregene HotStar Taq DNT Polimerazından istifadə edir.

◮ Optimallaşdırılmış reaksiya sistemi reaksiyanın daha yüksək aşkarlama həssaslığına, daha güclü termal sabitliyə və daha yaxşı tolerantlığa malik olmasını təmin edir.

◮ RT-qPCR Asan^TM(One Step)-SYBR Green I dəsti ROX daxili istinad boyası ilə gəlir, o, quyular arasında siqnal fonunu və siqnal xətalarını aradan qaldırmaq üçün istifadə edilə bilər ki, bu da müştərilərin kəmiyyət PCR alətlərinin müxtəlif modellərində istifadə etməsi üçün əlverişlidir.

RT Asan^TMII (Üçün Master Premiks üçün birinci zəncir cDNT sinteziReal Time PCR)

-2 dəqiqə ərzində şablondakı gDNT-ni çıxara bilən gDNT-ni çıxarmaq üçün effektiv qabiliyyət.

-Effektiv tərs transkripsiya sistemi, cDNT-nin birinci zəncirinin sintezini tamamlamaq üçün cəmi 15 dəqiqə çəkir.

-Mürəkkəb şablonlar: yüksək GC məzmunu və mürəkkəb ikinci dərəcəli strukturu olan şablonlar da yüksək effektivliklə geri çevrilə bilər.

-Yüksək həssaslığa malik tərs transkripsiya sistemi, pg səviyyəli şablonlar da yüksək keyfiyyətli cDNA əldə edə bilir.

-Tərs transkripsiya sistemi yüksək istilik sabitliyinə malikdir, optimal reaksiya temperaturu 42 ℃-dir və hələ də 50 ℃-də yaxşı tərs transkripsiya performansına malikdir.