RT-qPCR molekulyar biologiyanın əsas təcrübəsidir və hər kəs onunla tanış olmalıdır.Bu, əsasən üç addımdan ibarətdir: RNT çıxarılması, cDNA-ya əks transkripsiya və real vaxtda flüoresan kəmiyyət PCR.Faydalı deyil, nə baş verir?Çox güman ki, problem varəks transkripsiya təcrübəsi!Görünür ki, əks transkripsiya təcrübəsi yalnız RNT, dNTP, primerlər vəəks transkriptazasantrifüj borusuna qoyun və yaxşı qarışdırın, lakin faktiki əməliyyat prosesində hələ də diqqət yetirilməli olan bir çox detal var.Gəlin bu barədə öyrənək!

RNT keyfiyyətini necə qiymətləndirmək olar?
cDNA əldə etmək üçün RNT keyfiyyəti vacibdir!RNT keyfiyyəti əsasən iki aspektdən aşkar edilə bilər:
(1) RNT bütövlüyü:RNT bütövlüyü agaroz gel elektroforezi ilə yoxlanıla bilər. Eukariotları nümunə götürsək, tam ümumi RNT üç aydın zolaqdan ibarətdir, molekulyar çəkilər böyükdən kiçiyə 28S, 18S və 5S, 28S isə 18S-dən iki dəfə parlaqdır;üç zolaq görünsə, lakin zolaq növü bulanıqdırsa və ya Diffuziya RNT-nin qismən deqradasiyası deməkdir.Bu zaman lütfən, tərs transkripsiya reaksiyasını dərhal yerinə yetirin və şablon daxiletməsini müvafiq şəkildə artırın;yalnız kiçik molekulyar çəkiyə malik bir band və ya heç bir bant görünmürsə, RNT tamamilə parçalanmışdır və yenidən ekstraksiya edilməlidir.Agilent 2100 pik diaqramı və RIN dəyəri ilə RNT-nin bütövlüyünü göstərir.Əgər nuklein turşusu bütövdürsə, elektroferoqrammanın əsas xətti düzdür;nuklein turşusu ciddi şəkildə pozulursa, əsas xətt qeyri-bərabərdir və daha çox deqradasiya pikləri görünür;RIN-in dəyəri RNT-nin bütövlüyünü əks etdirir, 0-10 diapazonunda, dəyər nə qədər böyük olarsa, RNT-nin keyfiyyəti bir o qədər yaxşı olar.Yaxşı, tamlıq dərəcəsi nə qədər yüksəkdir.
(2) RNT-nin saflığı:OD260/280 nisbəti UV spektrofotometriyası ilə aşkar edilə bilər.OD260/280 nisbəti 1,9 ilə 2,1 arasındadırsa, təmizlik çox yaxşıdır.
Qalıq genomik DNT qeyri-dəqiq kəmiyyət nəticələrə səbəb ola bilər
RNT çıxarıldıqda, əldə etdiyimiz RNT təmizlənməmiş genomik DNT (gDNA) ilə qarışa bilər.Buna görə də, əks transkripsiyadan sonra cDNT də qarışdırılacaqgDNT.Aşağı axın zamanıqPCRreaksiya,cDNAvə gDNT eyni vaxtda gücləndirilə bilər, nəticədə nisbətən kiçik CT dəyəri yaranır, buna görə də nəticələr qərəzli ola bilər.
Bəs bu vəziyyətdə nə etməliyik?Foregenetəklif edir:
(1) RNT çıxarılması zamanı sütunun çıxarılması ilə çıxarıla bilən tərs RNT-də genomun təmizlənməsini həyata keçirin;
(2) Çıxarılan RNT-ni DNaz ilə müalicə edinI , lakin onu EDTA ilə dayandırın;
əks transkripsiya reagentlərigenom təmizləmə modulları ilə;

Əks transkripsiya üçün primerləri necə seçmək olar?
Əks transkripsiya primerləri də əks transkripsiya reaksiyasının nəticəsinə təsir göstərir.Təcrübənin xüsusi şərtlərinə uyğun olaraq tərs transkripsiya üçün təsadüfi primerləri, Oligo dT və ya gen-spesifik primerləri seçə bilərsiniz:
(1) Xüsusi transkriptlər: gen spesifik primerlər tövsiyə olunur;
(2) Uzun fraqment transkriptləri: Oligo dT/gen spesifik primerlər tövsiyə olunur;
(3) Uzun seqmentli transkriptlərin daxili fraqmentləri: gen spesifik primerlər/ təsadüfi primerlər / təsadüfi primerlər + Oligo dT.Sonrakı qPCR təcrübəsi həyata keçirilərsə, Oligo dT tək istifadə edilə bilməz, çünki Oligo dT-dən tək istifadə 3′ son qərəzliliyə səbəb ola bilər və qeyri-dəqiq qPCR təcrübə nəticələrinə gətirib çıxara bilər;
(4) miRNT: Gövdəli astarlar və ya quyruq astarları istifadə edilə bilər.

Əks transkripsiya məhsulu cDNA kəmiyyətin müəyyən edilməsi üçün neçə dəfə seyreltilməlidir?
Əks transkripsiya məhsulunun cDNA-sını əldə etdikdən sonra qPCR təcrübələri üçün cDNA-nın neçə dəfə seyreltilməli olduğu çox vacibdir.cDNA konsentrasiyası çox yüksək və ya çox aşağı olarsa, gücləndirmə səmərəliliyinə təsir edə bilər.cDNT konsentrasiyası ölçülə bilərmi və bunu necə etmək lazımdır?
(1) Əks transkripsiya məhsulunun cDNA konsentrasiyası ölçülə bilməz, çünki cDNA məhsuluna əlavə olaraq əks transkripsiya məhsulunda əks transkripsiyanın qalıq Buferi, əks transkriptaza, primerlər və s. var ki, bu da konsentrasiyanın ölçülməsi nəticələrinə müdaxilə edəcək və OD260/280, OD260/280, OD260/280-ə səbəb olacaq və buna görə də OD260/anormal nisbəti əks etdirmir.Bu zaman bəzi dostlar deyəcəklər, sonra təmizləndikdən sonra konsentrasiyanı ölçəcəm;burada,Foregene xatırlatmaq istərdi ki, cDNA-nın təmizlənməsi tövsiyə edilmir, çünki tərs çevrilmə nəticəsində əldə edilən cDNT-nin uzunluğu fərqlidir və qısa cDNA təmizlənmə zamanı itiriləcəkdir.
(2) Bəs nə etməli?qPCR təcrübəsindən əvvəl cDNA-nın seyreltmə qradiyenti ilkin təcrübə vasitəsilə müəyyən edilə bilər.Məsələn: qPCR təcrübələri üçün şablon kimi cDNA ehtiyat məhlulu, 10 qat qatılma və 100 qat qatılma istifadə edin və 18-28 diapazonunda CT dəyəri ilə seyreltmə amilini seçin.

MiRNA-lar necə tərs transkripsiya edilməlidir?
miRNA, zülal kodlaşdırmayan, təqribən 22 nt ölçüsünə malik bir zəncirli kiçik molekul RNT-dir.Qısa uzunluğuna görə adi qPCR metodu onu birbaşa ölçmək çətindir, ona görə də tez-tez miRNA-nı uzatmaq lazımdır;miRNA üçün tez-tez istifadə edilən tərs transkripsiya üsullarına kök döngə üsulu və quyruq metodu daxildir.
Stem-loop metodu, kök döngə primerləri əlavə etməklə miRNT-ni genişləndirməkdir.Bu aşkarlama metodu daha yüksək həssaslığa və spesifikliyə malikdir, lakin aşkarlama qabiliyyəti aşağıdır.Bir tərs transkripsiya yalnız bir miRNA və daxili istinadı aşkar edə bilər;quyruq əlavə etmə üsulu ikidən ibarətdir. Bu iki fermentin birgə təsiri ilə tamamlanır, bunlar PoliA polimeraza və əks transkriptazadır.PolyA polimeraza uzunluğunu artırmaq üçün miRNA-ya PolyA quyruğu əlavə etməkdən məsuldur və əks transkriptaza əks transkripsiya reaksiyasını həyata keçirir.Bu metod yüksək aşkarlama ötürmə qabiliyyətinə malikdir və bir tərs transkripsiyada çoxlu miRNA və daxili istinadları aşkar edə bilir, lakin kök döngə metodunda həssaslıq və spesifiklik aşağıdır.