Fikrimcə, aşkarlama texnologiyası tarixində bir neçə inqilabi ixtira antigen-antikor spesifik bağlanma, PCR texnologiyası və ardıcıllıq texnologiyası prinsipinə əsaslanan immunolabelinq texnologiyasıdır.Bu gün biz PCR texnologiyası haqqında danışacağıq.PCR texnologiyasının təkamülünə görə, insanlar adətən PCR texnologiyasını üç nəsilə bölürlər: adi PCR texnologiyası, real vaxt flüoresan kəmiyyət PCR texnologiyası və rəqəmsal PCR texnologiyası.
Common PCR texnikası
KARY MULLIS (1944.12.28-2019.8.7)
Kari Mullis 1983-cü ildə polimeraza zəncirvari reaksiyasını (polimeraza zəncirvari reaksiya, PCR) icad etdi. Deyilənə görə, o, sevgilisini idarə edərkən qəflətən ruhlandı və PCR prinsipi (sürücünün faydaları haqqında) haqqında fikirləşdi.Kari Mullis 1993-cü ildə Kimya üzrə Nobel Mükafatına layiq görülüb. The New York Times şərh edir: “Yüksək orijinal və əhəmiyyətlidir, demək olar ki, biologiyanı PCR-dən əvvəlki və PCR-dən sonrakı dövrlərə ayırır.
PCR prinsipi: DNT polimerazanın katalizində ana zəncir DNT şablon kimi, spesifik primer isə uzanmanın başlanğıc nöqtəsi kimi istifadə olunur və ana zəncir zəncirinin şablon DNT-ni tamamlayan qız zəncirinin DNT-si denatürasiya, yumşalma, uzatma və digər addımlar vasitəsilə in vitro surətdə kopyalanır.Bu, hər hansı bir hədəf DNT-ni in vitro sürətlə və spesifik olaraq gücləndirə bilən in vitro DNT sintezinin gücləndirilməsi texnologiyasıdır.
Adi PCR-nin üstünlükləri
1.Klassik üsul, tam beynəlxalq və yerli standartlar
2.Alət reagentlərinin aşağı qiyməti
3.PCR məhsulları digər molekulyar biologiya təcrübələri üçün bərpa edilə bilər
Tövsiyə olunan Foregene PCR maşını: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
Əlaqədar məhsullar: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
Adi PCR-nin çatışmazlıqları
1.asanlıqla çirkləndirir
2.çətin əməliyyat
3.yalnız keyfiyyət təhlili
4.Orta həssaslıq
5.Qeyri-spesifik gücləndirmə var və qeyri-spesifik zolaq hədəf diapazonla eyni ölçüdə olduqda, onu ayırd etmək mümkün deyil.
Capiller elektroforez əsasında PCR
Adi PCR-nin çatışmazlıqlarına cavab olaraq, bəzi istehsalçılar kapilyar elektroforez prinsipinə əsaslanan alətlər təqdim etdilər.Kapilyarda PCR gücləndirilməsindən sonra elektroforez mərhələsi tamamlanır.Həssaslıq daha yüksəkdir və bir neçə əsasın fərqini ayırd etmək və gücləndirməni MAERKER ilə hesablamaq olar.məhsulun məzmunu.Dezavantaj ondan ibarətdir ki, PCR məhsulu hələ də açılmalı və alətə qoyulmalıdır və hələ də böyük çirklənmə riski var.
CapillerEelektroforez
2. Real vaxtda flüoresan kəmiyyət PCR (Kəmiyyət real vaxtlı PCR, qPCR) texnologiyasıFlüoresan kəmiyyət PCR, həmçinin Real-Time PCR adlanır, 1995-ci ildə PE (Perkin Elmer) tərəfindən hazırlanmış yeni nuklein turşusu kəmiyyət texnologiyasıdır. Floresan kəmiyyət PCR-nin inkişaf tarixi ABI, Roche və Bio-Rad kimi nəhənglərin ruhu qarışdıran mübarizələrinin tarixidir.Əgər maraqlanırsınızsa, yoxlaya bilərsiniz.Bu texnika hazırda ən yetkin və geniş istifadə olunan yarı kəmiyyətli PCR üsuludur.
Tövsiyə olunan qPCR Maşın:https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/
Floresan boyama üsulu (SYBR Green I):SYBR Green I kəmiyyət PCR üçün ən çox istifadə edilən DNT-ni birləşdirən boyadır, o, qeyri-spesifik olaraq ikiqat zəncirli DNT-yə bağlanır.Sərbəst vəziyyətdə, SYBR Green zəif flüoresans yayır, lakin bir dəfə ikiqat zəncirli DNT-yə bağlandıqda onun flüoresansı 1000 dəfə artır.Buna görə də, reaksiya tərəfindən buraxılan ümumi flüoresan siqnal mövcud ikiqat zəncirli DNT miqdarı ilə mütənasibdir və gücləndirilmiş məhsulun artması ilə artacaqdır.Boya qeyri-spesifik olaraq ikiqat zəncirli DNT-yə bağlandığından, yanlış müsbət nəticələr yarana bilər.
Əlaqədar məhsullar: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/
Floresan zond üsulu (Təqman texnologiyası): zamanıPCR gücləndirilməsi, xüsusi bir flüoresan prob bir cüt primerlə eyni vaxtda əlavə edilir.Zond xətti oliqonukleotiddir, hər iki ucunda müvafiq olaraq flüoresan məruzəçi qrupu və flüoresan söndürmə qrupu etiketlənir.Zond bütöv olduqda, reportyor qrupu tərəfindən buraxılan flüoresan siqnal söndürücü qrup tərəfindən udulur və aşkarlama Flüoresan siqnal yoxdur;PCR amplifikasiyası zamanı (uzatma mərhələsində) Taq fermentinin 5'-3' Dicer fəaliyyəti probu həzm edəcək və deqradasiya edəcək, beləliklə reportyor flüoresan qrupu və söndürücü flüoresan qrupu ayrılacaq, beləliklə flüoresan monitorinq sistemi Floresan siqnalı alına bilsin, yəni hər dəfə DNT zənciri və ya qripin tam gücləndirildiyi zaman, flüoresan siqnalların yığılması və PCR məhsullarının formalaşması.Təqman prob metodu klinik aşkarlamada ən çox istifadə edilən aşkarlama üsuludur.
Əlaqədar məhsullar: https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/
qPCR-nin üstünlükləri
1.Metod yetkindir və dəstəkləyici avadanlıq və reagentlər tamdır
2.Reagentlərin orta qiyməti
3.istifadəsi asan
4.Yüksək aşkarlama həssaslığı və spesifikliyi
qPCR-nin çatışmazlıqları
Hədəf genin mutasiyası buraxılmış aşkarlamaya gətirib çıxarır.
Aşağı konsentrasiyalı şablonun aşkarlama nəticəsi müəyyən edilə bilməz.
Kəmiyyət aşkarlanması üçün standart əyridən istifadə edərkən böyük xəta var.
3. Rəqəmsal PCR (rəqəmsal PCR, dPCR) texnologiyası
Rəqəmsal PCR nuklein turşusu molekullarının mütləq kəmiyyətini təyin etmək üçün bir üsuldur.qPCR ilə müqayisədə rəqəmsal PCR birbaşa DNT/RNT molekullarının sayını oxuya bilər ki, bu da başlanğıc nümunədəki nuklein turşusu molekullarının mütləq kəmiyyət göstəricisidir.1999-cu ildə Bert Vogelstein və Kenneth W. Kin-zler rəsmi olaraq dPCR konsepsiyasını təklif etdilər.
2006-cı ildə Fluidigm kommersiya çip əsaslı dPCR aləti istehsal edən ilk şirkət oldu.2009-cu ildə Life Technologies OpenArray və QuantStudio 12K Flex dPCR sistemlərini işə saldı.2013-cü ildə Life Technologies nümunələri 20.000 fərdi hüceyrəyə bərabər paylamaq üçün yüksək sıxlıqlı nanoölçülü mikrofluidik çip texnologiyasından istifadə edən QuantStudio 3DdPCR sistemini işə saldı.reaksiya yaxşı.
2011-ci ildə Bio-Rad damcı əsaslı QX100 dPCR alətini işə saldı, bu cihaz nümunəni 20.000 damcı-neft-su-neftə bərabər paylamaq üçün yağda su texnologiyasından istifadə edir və damcıları analiz etmək üçün damcı analizatorundan istifadə edir.2012-ci ildə RainDance hər bir standart reaksiya sistemini 1 milyondan 10 milyon pikolitr səviyyəli mikro damcıdan ibarət reaksiya emulsiyasına bölmək üçün yüksək təzyiqli qazla idarə olunan RainDrop dPCR alətini işə saldı.
İndiyə qədər rəqəmsal PCR iki əsas fraksiya yaratmışdır, çip növü və damlacıq növü.Rəqəmsal PCR növündən asılı olmayaraq, onun əsas prinsipləri seyreltmə, son nöqtə PCR və Poisson paylanmasıdır.Nuklein turşusu şablonlarını ehtiva edən standart PCR reaksiya sistemi bərabər şəkildə çiplərə və ya mikrodamcılara paylanan on minlərlə PCR reaksiyasına bölünür ki, hər bir reaksiyada mümkün qədər çox şablon molekul var və bir molekullu şablon PZR reaksiyası həyata keçirilir.Flüoresansın oxunması ilə siqnalın mövcudluğu və ya olmaması hesablanır və mütləq kəmiyyət təyini statistik Puasson paylanmasının kalibrlənməsindən sonra həyata keçirilir.
İstifadə etdiyim bir neçə rəqəmsal PCR platformasının xüsusiyyətləri aşağıdakılardır:
1. Bio-Rad QX200 damcı rəqəmsal PCR Bio-RadQX200 çox klassik rəqəmsal PCR platformasıdır, əsas aşkarlama prosesi: 20.000 nümunə damcı generatoru tərəfindən yaradılır Yağda su mikro damcıları adi PCR aparatında gücləndirilir və nəhayət, hər bir mikro damcının flüoresan siqnalı mikro damcı oxuyucusu tərəfindən oxunur.Əməliyyat daha mürəkkəbdir və çirklənmə riski orta səviyyədədir.
Xinyi TD1 mikro-damcılı rəqəmsal PCRXinyi TD1 yerli rəqəmsal PCR platformasıdır, əsas aşkarlama prosesi: damcı generatoru vasitəsilə 30,000-50,000 yağda su damcıları yaradın, ümumi PCR alətində gücləndirin və nəhayət keçir. Damcı oxuyucusu hər damcının flüoresan siqnalını oxuyur.Həm damlacıqların yaranması, həm də bu platformada oxunması çirklənmə riski az olan xüsusi çipdə həyata keçirilir.
STILLA Naica mikro-damcı çipi rəqəmsal PCRSTILLA Naica nisbətən yeni rəqəmsal PCR platformasıdır.Əsas aşkarlama prosesi belədir: reaksiya məhlulunu çipə əlavə edin, çipi mikro damcı generasiya və gücləndirmə sisteminə qoyun və 30 000 mikro damcı yaradın.Çipin üzərinə yayılır və çipdə PCR gücləndirilməsi tamamlanır.Sonra gücləndirilmiş çip mikro-damcı oxuma analizi sisteminə ötürülür və flüoresan siqnal şəkillər çəkərək oxunur.Bütün proses qapalı çipdə baş verdiyi üçün çirklənmə riski azdır.
4. ThermoFisher QuantStudio 3D çip rəqəmsal PCR
ThermoFisher QuantStudio 3D başqa bir klassik çip əsaslı rəqəmsal PCR platformasıdır.Onun əsas aşkarlama prosesi belədir: reaksiya məhlulunu yayıcıya əlavə edin və reaksiya məhlulunu yayıcı vasitəsilə 20.000 mikro quyu ilə çipin üzərinə bərabər şəkildə yayın., gücləndirmək üçün çipi PCR maşınına qoyun və nəhayət, çipi oxuyucuya qoyun və flüoresan siqnalı oxumaq üçün şəkil çəkin.Əməliyyat nisbətən mürəkkəbdir və bütün proses qapalı çipdə aparılır və çirklənmə riski azdır.
5. JN MEDSYS Clarity chip rəqəmsal PCR
JN MEDSYS Clarity nisbətən yeni çip tipli rəqəmsal PCR platformasıdır.Onun əsas aşkarlama prosesi belədir: reaksiya məhlulunu aplikatora əlavə edin və reaksiya məhlulunu aplikator vasitəsilə PCR borusuna sabitlənmiş 10 000 PCR borusuna bərabər şəkildə yayın.Mikroməsaməli çipdə reaksiya məhlulu kapilyar təsir vasitəsilə çipə daxil olur və çipli PZR borusu gücləndirmək üçün PZR aparatına yerləşdirilir və nəhayət foto çəkərək flüoresan siqnalı oxumaq üçün çip oxucuya yerləşdirilir.Əməliyyat daha mürəkkəbdir.Çirklənmə riski azdır.
Hər bir rəqəmsal PCR platformasının parametrləri aşağıdakı kimi ümumiləşdirilir:
Rəqəmsal PCR platformasının qiymətləndirmə göstəriciləri bunlardır: bölünmüş bölmələrin sayı, flüoresan kanalların sayı, əməliyyatın mürəkkəbliyi və çirklənmə riski.Ancaq ən vacib şey aşkarlama dəqiqliyidir.Rəqəmsal PCR platformalarını qiymətləndirməyin bir yolu bir-birini yoxlamaq üçün çoxlu rəqəmsal PCR platformalarından istifadə etməkdir, digər üsul isə dəqiq dəyərlərə malik standart maddələrdən istifadə etməkdir.
dPCR-nin üstünlükləri
1.Mütləq kəmiyyətləşdirməyə nail olmaq
2.Daha yüksək həssaslıq və spesifiklik
3.Aşağı nüsxə nümunələrini aşkar edə bilər
dPCR-nin çatışmazlıqları1. Bahalı avadanlıq və reagentlər 2. Mürəkkəb əməliyyat və uzun aşkarlama müddəti 3. Dar aşkarlama diapazonu
Hazırda PCR texnologiyasının üç nəslinin öz üstünlükləri və mənfi cəhətləri var və hər birinin öz tətbiq sahələri var və bir nəslin digərini əvəz etməsi münasibət deyil.Texnologiyanın davamlı inkişafı PCR texnologiyasına yeni canlılıq qazandıraraq, ona bir tətbiq istiqamətini digərinin ardınca açmağa imkan verir, nuklein turşusunun aşkarlanmasını daha rahat və dəqiq edir.
Mənbə: Doktor Yuan sizi imtahana aparır
Tövsiyə olunan məhsullar:
Göndərmə vaxtı: 18 noyabr 2022-ci il
