PCR ən çox istifadə edilən nuklein turşusunun gücləndirilməsi texnologiyasıdır və həssaslığına və spesifikliyinə görə geniş istifadə olunur.Bununla belə, PCR təkrar termal denatürasiya tələb edir və klinik sahədə sınaqda onun tətbiqini məhdudlaşdıran alət və avadanlıqlara əsaslanan məhdudiyyətlərdən xilas ola bilmir.

1990-cı illərin əvvəllərindən etibarən bir çox laboratoriyalar istilik denaturasiyası tələb etməyən sabit temperaturun gücləndirilməsi texnologiyasını inkişaf etdirməyə başladılar.İndi onlar döngə vasitəçiliyi ilə izotermik gücləndirmə texnologiyasını, tel əvəzedici izotermik gücləndirmə texnologiyasını, yuvarlanan dairənin izotermik gücləndirmə texnologiyasını və nuklein turşusu ardıcıllığından asılılığı inkişaf etdirdilər.İzotermik gücləndirmə texnologiyası və digər texnologiyalar. 

Loop vasitəli izotermik gücləndirmə

Gücləndirmə prinsipi DNT-nin təxminən 65°C-də dinamik tarazlıq vəziyyətində olmasına əsaslanır.Hər hansı bir primer əsas qoşalaşdıqda və ikiqat zəncirli DNT-nin tamamlayıcı hissəsinə qədər uzandıqda, digər zəncir parçalanaraq tək zəncirli olur.

Bu temperaturda DNT zəncirli yerdəyişmə DNT polimerazına güvənmək üçün 4 xüsusi primerdən istifadə edərək zəncirli yerdəyişmə DNT-nin sintezini davamlı olaraq öz-özünə dövrə vurur.

Əvvəlcə hədəf gendə 6 spesifik bölgə F3, F2, F1, B1, B2, B3 təyin edin və sonra bu 6 spesifik bölgə əsasında 4 primer dizayn edin (aşağıdakı şəkildə göstərildiyi kimi):

İrəli daxili primer (FIP) F1c və F2-dən ibarətdir.

Geriyə doğru daxili astar (BIP) B1c və B2-dən ibarətdir və TTTT ortada boşluq kimi istifadə olunur.

Xarici primerlər F3 və B3 müvafiq olaraq hədəf gen üzərində F3 və B3 bölgələrindən ibarətdir.

LAMP reaksiya sistemində daxili primerin konsentrasiyası xarici primerdən bir neçə dəfə çoxdur.Daxili primer əvvəlcə şablon zəncirlə birləşdirilir və DNT ikiqat zəncirini meydana gətirmək üçün tamamlayıcı zəncir sintez edilir.Sonradan, xarici primer DNT cüt zəncirini yaratmaq üçün şablon zəncirlə birləşdirilir.BstDNA polimerazının təsiri altında daxili primer tərəfindən sintez edilən tamamlayıcı zəncir sərbəst buraxılır.Bir sıra reaksiyalardan sonra tamamlayıcı zəncir nəhayət dumbbell quruluşuna malik tək DNT zəncirini əmələ gətirir.

Dumbbell strukturu DNT tək zəncirinin özü davamlı olaraq açıq ucu olan keçid kök-döşəmə strukturu DNT yaratmaq üçün şablon kimi istifadə olunur.Daxili və xarici primerlər keçid gövdəsi-halqa strukturu DNT-ni davamlı olaraq zəncirlə yerdəyişmə və uzatma reaksiyalarından keçmək üçün istiqamətləndirir və nəhayət, müxtəlif uzunluqlarda çoxlu gövdə-halqa strukturları əmələ gətirir.DNT qarışığı.

Döngə vasitəsi ilə izotermik gücləndirmənin üstünlükləri və mənfi cəhətləri

LAMP-ın üstünlükləri:

(1) 1 saat ərzində hədəf genin 1-10 nüsxəsini effektiv şəkildə gücləndirə bilən yüksək gücləndirmə səmərəliliyi və gücləndirmə səmərəliliyi adi PCR-dən 10-100 dəfə çoxdur.

(2) Reaksiya müddəti qısadır, spesifiklik güclüdür və xüsusi avadanlıq tələb olunmur.

LAMP-ın çatışmazlıqları:

(1) Astarlara olan tələblər xüsusilə yüksəkdir.

(2) Gücləndirilmiş məhsul klonlama və ardıcıllıq üçün istifadə edilə bilməz, lakin yalnız mühakimə üçün istifadə edilə bilər.

(3) Güclü həssaslığına görə, aerozollar əmələ gətirmək asandır, yanlış müsbət nəticələrə səbəb olur və test nəticələrinə təsir göstərir.

Strand yerdəyişməsi gücləndirilməsi

Strand yerdəyişmə amplifikasiyası (SDA) ilk dəfə 1992-ci ildə Amerika alimi Uoker tərəfindən təklif edilən fermentativ reaksiyaya əsaslanan in vitro izotermal DNT gücləndirmə üsuludur.

SDA-nın əsas sisteminə məhdudlaşdırıcı endonükleaza, zəncirlə yerdəyişmə aktivliyi olan DNT polimeraza, iki cüt primer, dNTP, kalsium və maqnezium ionları və tampon sistemləri daxildir.

Telin yerdəyişməsinin gücləndirilməsi prinsipi hədəf DNT-nin hər iki ucunda kimyəvi cəhətdən dəyişdirilmiş məhdudlaşdırıcı endonükleazın tanınması ardıcıllığına əsaslanır.Endonükleaza tanınma yerində DNT zəncirindəki boşluğu açır və DNT polimeraza 3′ boşluğu genişləndirir və növbəti DNT zəncirini əvəz edir.

DNT-nin dəyişdirilmiş tək zəncirləri primerlərlə birləşdirilə və DNT polimeraza ilə ikiqat zəncirlərə uzadıla bilər.Bu proses davamlı olaraq təkrarlanır, beləliklə hədəf ardıcıllığı səmərəli şəkildə gücləndirilir.

Strand yerdəyişmə gücləndirmə texnologiyasının üstünlükləri və mənfi cəhətləri

SDA-nın üstünlükləri:

Gücləndirmə səmərəliliyi yüksəkdir, reaksiya müddəti qısadır, spesifiklik güclüdür və xüsusi avadanlıq tələb olunmur.

SDA-nın çatışmazlıqları:

Məhsullar vahid deyil, bəzi tək və iki telli məhsullar həmişə SDA dövründə istehsal olunur və elektroforez ilə aşkar edildikdə, tullantı qaçılmaz olaraq baş verəcəkdir.

Rolling dairəsinin gücləndirilməsi

Yuvarlanan dairənin gücləndirilməsi (RCA) yuvarlanan dairə ilə patogen orqanizmlərdən DNT-nin surətinin çıxarılması üsuluna əsaslanaraq təklif olunur.Bu, sabit bir temperaturda şablon kimi tək zəncirli dairəvi DNT-nin istifadəsinə və hədəf genin gücləndirilməsinə nail olmaq üçün yuvarlanan dairə DNT sintezinin təsiri altında xüsusi bir DNT polimerazına (məsələn, Phi29) aiddir.

RCA xətti gücləndirmə və eksponensial gücləndirməyə bölünə bilər.Xətti RCA-nın səmərəliliyi 10-a çata bilər⁵dəfə və eksponensial RCA-nın səmərəliliyi 10-a çata bilər⁹dəfə.

Sadə fərq, aşağıdakı şəkildə göstərildiyi kimi, xətti gücləndirmə a yalnız 1 primerdən istifadə edir, eksponensial gücləndirmə b-də 2 primer var.

Xətti RCA da tək primer RCA adlanır.Primer dairəvi DNT-yə bağlanır və DNT polimerazının təsiri ilə genişlənir.Məhsul bir döngənin uzunluğundan minlərlə dəfə çox sayda təkrarlanan ardıcıllığa malik xətti tək teldir.

Xətti RCA məhsulu həmişə başlanğıc primerlə əlaqəli olduğundan, siqnalın asan fiksasiyası əsas üstünlükdür.

Eksponensial RCA, həmçinin Hiper budaqlanmış gücləndirmə HRCA (Hyper dallanmış RCA) kimi tanınan eksponensial RCA-da bir primer RCA məhsulunu gücləndirir, ikinci primer RCA məhsulu ilə hibridləşir və uzanır və əvəzedici artıq RCA məhsuluna bağlıdır.

Yuvarlanan dairənin nuklein turşusunun gücləndirilməsinin üstünlükləri və mənfi cəhətləri

RCA-nın üstünlükləri:

Yüksək həssaslıq, yaxşı spesifiklik və asan əməliyyat.

RCA-nın çatışmazlıqları:

Siqnalın aşkarlanması zamanı fon problemləri.RCA reaksiyası zamanı dövriyyəsiz asma kilid zondu və bağlanmamış zondun şablon DNT və ya RNT bəzi fon siqnalları yarada bilər. 

Nukleikasidlərin ardıcıllığına əsaslanan gücləndirmə

Nuklein turşusu ardıcıllığına əsaslanan gücləndirmə (NASBA) PCR əsasında hazırlanmış yeni texnologiyadır.Bu, T7 promotor ardıcıllığı olan bir cüt primer tərəfindən idarə olunan davamlı və izotermik nuklein turşusunun gücləndirilməsidir.Texnologiya təxminən 2 saat ərzində şablon RNT-ni təxminən 109 dəfə gücləndirə bilir ki, bu da adi PCR metodundan 1000 dəfə yüksəkdir və xüsusi avadanlıq tələb etmir.

Bu texnologiya ortaya çıxan kimi xəstəliklərin sürətli diaqnostikası üçün istifadə edilmişdir və hazırda bir çox şirkət RNT aşkarlama dəstlərində bu üsuldan istifadə edir.

RNT gücləndirilməsi tərs transkripsiya PCR texnologiyasından da istifadə edə bilsə də, NASBA-nın öz üstünlükləri var: o, nisbətən sabit temperatur şəraitində həyata keçirilə bilər və ənənəvi PCR texnologiyasından daha stabil və dəqiqdir.

Reaksiya 41 dərəcə Selsi səviyyəsindədir və tamamlamaq üçün AMV (quş mieloblastozu virusu) əks transkriptaza, RNase H, T7 RNT polimeraza və bir cüt primer tələb olunur.

Prosesə əsasən aşağıdakılar daxildir:

İrəli primer T7 promotorunun tamamlayıcı ardıcıllığını ehtiva edir.Reaksiya zamanı irəli primer RNT zəncirinə bağlanır və DNT-RNT cüt zəncirini yaratmaq üçün AMV fermenti tərəfindən katalizlənir.

RNase H hibrid cüt zəncirdə RNT-ni həzm edir və tək zəncirli DNT-ni saxlayır.

Əks primerin və AMV fermentinin təsiri altında T7 promotor ardıcıllığını ehtiva edən DNT ikiqat zəncir əmələ gəlir.

T7 RNT polimerazının təsiri altında transkripsiya prosesi başa çatır və böyük miqdarda hədəf RNT istehsal olunur.

NASBA-nın üstünlükləri:

(1) Onun primerində T7 promotor ardıcıllığı var, lakin yad cüt zəncirli DNT-də T7 promotor ardıcıllığı yoxdur və gücləndirilə bilməz, ona görə də bu texnologiya yüksək spesifikliyə və həssaslığa malikdir.

(2) NASBA birbaşa əks transkripsiya prosesini gücləndirmə reaksiyasına daxil edərək reaksiya müddətini qısaldır.

NASBA-nın çatışmazlıqları:

(1) Reaksiya komponentləri daha mürəkkəbdir.

(2) Reaksiya dəyərini artırmaq üçün üç növ ferment tələb olunur.