Ct dəyəri floresan kəmiyyət PCR-nin ən vacib nəticə təqdimetmə formasıdır.Gen ifadə fərqlərini və ya gen nüsxə sayını hesablamaq üçün istifadə olunur.Beləliklə, ağlabatan hesab edilən flüoresans kəmiyyətinin Ct dəyəri nədir?Ct dəyərinin effektiv diapazonunu necə təmin etmək olar?
Ct Dəyəri nədir?
qPCR gücləndirmə prosesi zamanı gücləndirilmiş məhsulun flüoresan siqnalı müəyyən edilmiş flüoresans həddinə çatdıqda, gücləndirmə dövrlərinin müvafiq sayı (Cycle Threshold).C Cycle və T Threshold deməkdir.Sadə dillə desək, Ct dəyəri ilkin şablon gücləndirilməsi qPCR-də məhsulun müəyyən miqdarına çatdığı zaman uyğun gələn dövrlərin sayıdır."Müəyyən miqdarda məhsul" adlanan şey daha sonra izah ediləcəkdir.
Ct dəyəri nə edir?
1. Eksponensial gücləndirmə, şablon miqdarı və Ct dəyəri arasında əlaqə
İdeal olaraq, qPCR-də genlər müəyyən sayda dövrlərdən sonra eksponensial gücləndirmə yolu ilə toplanır.Gücləndirmə dövrlərinin sayı ilə məhsulların miqdarı arasında əlaqə belədir: Gücləndirilmiş məhsulun miqdarı = ilkin şablon məbləği × (1+En) dövrlərin sayı.Bununla belə, qPCR reaksiyası həmişə ideal vəziyyətdə olmur.Gücləndirilmiş məhsulun miqdarı "müəyyən məhsul miqdarına" çatdıqda, bu anda dövrlərin sayı Ct dəyəridir və eksponensial gücləndirmə dövründədir.Ct dəyəri ilə başlanğıc şablonun miqdarı arasında əlaqə: Şablonun Ct dəyəri ilə şablonun başlanğıc nüsxə nömrəsinin loqarifmi arasında xətti əlaqə var.İlkin şablon konsentrasiyası nə qədər yüksək olsa, Ct dəyəri bir o qədər kiçik olar;ilkin şablon konsentrasiyası nə qədər aşağı olarsa, Ct dəyəri bir o qədər böyük olar.
2.Amplifikasiya əyrisi, flüoresan həddi və müəyyən PCR məhsulu miqdarı
qPCR gücləndirmə məhsulunun miqdarı birbaşa flüoresan siqnal şəklində, yəni gücləndirmə əyrisi şəklində təqdim olunur.PCR-nin ilkin mərhələsində gücləndirmə ideal şəraitdə olur, dövrlərin sayı azdır, məhsulun yığılması azdır və flüoresans səviyyəsini flüoresan fondan aydın şəkildə ayırmaq olmur.Bundan sonra flüoresan artır və eksponensial faza daxil olur.PZR məhsulunun miqdarı, PCR reaksiyası yalnız eksponensial mərhələdə olduqda müəyyən bir nöqtədə aşkar edilə bilər ki, bu da “müəyyən miqdarda məhsul” kimi istifadə edilə bilər və şablonun ilkin məzmunu bundan çıxarıla bilər.Buna görə də, müəyyən miqdarda məhsula uyğun gələn flüoresan siqnal intensivliyi flüoresans həddidir.
PCR-in gec mərhələsində gücləndirmə əyrisi artıq eksponensial gücləndirməni göstərmir və xətti faza və yayla fazasına daxil olur.
3.Ct dəyərlərinin təkrar istehsalı
PCR dövrü Ct dəyərinin dövr nömrəsinə çatdıqda, o, əsl eksponensial gücləndirmə dövrünə yeni daxil olmuşdur.Bu zaman kiçik xəta gücləndirilməyib, ona görə də Ct dəyərinin təkrar istehsalı əladır, yəni eyni şablon müxtəlif vaxtlarda və ya müxtəlif borularda eyni vaxtda gücləndirilir.Gücləndirmə, alınan Ct dəyəri sabitdir.
1.Amplifikasiya səmərəliliyi En
PCR gücləndirmə səmərəliliyi polimerazın gücləndiriləcək geni amplikona çevirdiyi effektivliyə aiddir.Bir DNT molekulunun iki DNT molekuluna çevrildiyi zaman gücləndirmə səmərəliliyi 100% təşkil edir.Gücləndirmə səmərəliliyi adətən En kimi ifadə edilir.Sonrakı məqalələrin təhlilini asanlaşdırmaq üçün gücləndirmə səmərəliliyinə təsir edən amillər qısa şəkildə təqdim olunur.
| Təsir edən amillər | izahat | Necə mühakimə etmək olar? |
| A. PCR inhibitorları | 1. Şablon DNT-də zülallar və ya yuyucu vasitələr kimi PCR reaksiyasını maneə törədən maddələr var.2. Əks transkripsiyadan sonra cDNT şablon RNT və ya RT reagent komponentlərinin yüksək konsentrasiyasını ehtiva edir ki, bu da sonrakı PCR reaksiyasını maneə törədə bilər. | 1. Çirklənmənin olub-olmaması A260/A280 və A260/A230 və ya RNT elektroforezinin nisbətini ölçməklə müəyyən edilə bilər.2. Əks transkripsiyadan sonra cDNT-nin müəyyən nisbətə uyğun olaraq seyreltilib-söndürülməməsi. |
| B. Astarın düzgün tərtib edilməməsi | Astarlar effektiv şəkildə tavlanmır | Astar-dimerlər və ya saç sancaqları, uyğunsuzluqlar və bəzən intronik dizaynları əhatə edən primerləri yoxlayın. |
| C. Düzgün olmayan PCR reaksiya proqramının dizaynı | 1. Astarlar effektiv şəkildə tavlana bilməz2. DNT polimerazanın qeyri-kafi sərbəst buraxılması 3. Uzunmüddətli yüksək temperaturlu DNT polimeraz aktivliyi azalıb | 1. Yuvlama temperaturu primerin TM qiymətindən yüksəkdir2. Pre-denaturasiya müddəti çox qısadır 3. Reaksiya prosedurunun hər bir mərhələsinin vaxtı çox uzundur |
| D. Reagentlərin qeyri-kafi qarışdırılması və ya pipetləmə xətaları | Reaksiya sistemində PCR reaksiya komponentlərinin yerli konsentrasiyası çox yüksək və ya qeyri-bərabərdir, bu da PCR gücləndirilməsinin qeyri-eksponensial gücləndirilməsi ilə nəticələnir. | |
| E. Amplikonun uzunluğu | Amplikonun uzunluğu çox uzun, 300bp-dən çoxdur və gücləndirmə səmərəliliyi aşağıdır | Amplikonun uzunluğunun 80-300bp arasında olduğunu yoxlayın |
| F. qPCR reagentlərinin təsiri | Reagentdə DNT polimerazanın konsentrasiyası aşağıdır və ya buferdə ionların konsentrasiyası optimallaşdırılmayıb, nəticədə Taq fermentinin aktivliyi maksimuma çatmır. | Standart əyri ilə gücləndirmə səmərəliliyinin təyini |
2.Ct dəyərlərinin diapazonu
Ct dəyərləri 15-35 arasında dəyişir.Əgər Ct dəyəri 15-dən azdırsa, gücləndirmənin baza dövrünün diapazonunda olduğu və flüoresan həddi çatmadığı hesab edilir.İdeal olaraq, Ct dəyəri ilə şablonun ilkin surət nömrəsinin, yəni standart əyrinin loqarifmi arasında xətti əlaqə mövcuddur.Standart əyri vasitəsilə, gücləndirmə səmərəliliyi 100% olduqda, genin tək nüsxə nömrəsinin kəmiyyətini müəyyən etmək üçün hesablanmış Ct dəyəri təxminən 35-dir. Əgər 35-dən çox olarsa, şablonun ilkin nüsxə nömrəsi nəzəri olaraq 1-dən azdır, bu da mənasız hesab edilə bilər.
Müxtəlif gen Ct diapazonları üçün, ilkin şablon məbləğində gen surətinin sayı və gücləndirmə səmərəliliyindəki fərqə görə, gen üçün standart əyri tərtib etmək və genin xətti aşkarlama diapazonunu hesablamaq lazımdır.
3.Ct dəyərinin təsir edən amilləri
Gücləndirmə dövrlərinin sayı ilə məhsulun miqdarı arasındakı əlaqədən: gücləndirilmiş məhsulun miqdarı = ilkin şablonun miqdarı × (1+En) dövr nömrəsi, ideal şəraitdə ilkin şablonun miqdarının və En-in Ct dəyərinə mənfi təsir edəcəyini görmək olar.Şablon keyfiyyətində və ya gücləndirmə səmərəliliyindəki fərq Ct dəyərinin çox böyük və ya çox kiçik olmasına səbəb olacaq.
4.Ct dəyəri çox böyük və ya çox kiçikdir
Göndərmə vaxtı: 22 fevral 2023-cü il
