Molekulyar diaqnostika texnologiyası, xəstəliklərin proqnozlaşdırılması və diaqnostikası məqsədinə nail olmaq üçün insan orqanizminin genetik materialının və müxtəlif patogenlərin ifadəsini və strukturunu aşkar etmək üçün molekulyar biologiya metodlarından istifadə edir.

Son illərdə molekulyar diaqnostika texnologiyasının təkmilləşdirilməsi və təkrarlanması ilə molekulyar diaqnostikanın klinik tətbiqi getdikcə daha geniş və dərinləşdi və molekulyar diaqnostika bazarı sürətli inkişaf dövrünə qədəm qoydu.

Müəllif bazarda geniş yayılmış molekulyar diaqnostika texnologiyalarını ümumiləşdirir və üç hissəyə bölünür: birinci hissədə PCR texnologiyası, ikinci hissədə nuklein turşusunun izotermik gücləndirilməsi texnologiyası, ikinci hissədə isə ardıcıllıq texnologiyası təqdim olunur.

01

I hissə: PCR texnologiyası

PCR texnologiyası

PCR (polimeraza zəncirvari reaksiya) 30 ildən artıq tarixə malik olan in vitro DNT gücləndirmə texnologiyalarından biridir.

PCR texnologiyası 1983-cü ildə ABŞ-ın Cetusdan olan Kari Mullis tərəfindən yaradılmışdır.Mullis 1985-ci ildə PCR patenti üçün müraciət etdi və həmin ildə Elm üzrə ilk PCR akademik məqaləsini nəşr etdi.Mullis 1993-cü ildə kimya üzrə Nobel mükafatına layiq görülüb.

PCR-nin əsas prinsipləri

PCR hədəf DNT fraqmentlərini bir milyon dəfədən çox gücləndirə bilər.Prinsip ondan ibarətdir ki, DNT polimerazının katalizi altında ana zəncir DNT şablon kimi istifadə olunur və genişlənmə üçün başlanğıc nöqtəsi kimi xüsusi bir primer istifadə olunur.Denatürasiya, tavlama və uzatma kimi mərhələlərlə in vitro təkrarlanır.Ana zəncir şablonu DNT-ni tamamlayan qız zəncirinin DNT prosesi.

Standart PCR prosesi üç mərhələyə bölünür:

1. Denatürasiya: DNT cüt zəncirlərini ayırmaq üçün yüksək temperaturdan istifadə edin.DNT cüt zəncirləri arasındakı hidrogen bağları yüksək temperaturda (93-98°C) qırılır.

2. Qızdırma: İki zəncirli DNT ayrıldıqdan sonra, primerin tək zəncirli DNT-yə bağlana bilməsi üçün temperatur aşağı salınır.

3. Uzatma: DNT polimeraza temperatur aşağı salındıqda bağlanan primerlərdən DNT zəncirləri boyunca tamamlayıcı zəncirləri sintez etməyə başlayır.Uzatma tamamlandıqda, bir dövr tamamlanır və DNT fraqmentlərinin sayı ikiqat artır.

Bu üç addımı 25-35 dəfə təkrarlayan DNT fraqmentlərinin sayı eksponent olaraq artacaq.

PCR-in ixtiraçılığı ondan ibarətdir ki, müxtəlif primerlər müxtəlif hədəf genlər üçün nəzərdə tutula bilər, beləliklə hədəf gen fraqmentləri qısa müddət ərzində gücləndirilə bilər.

İndiyə qədər PCR üç kateqoriyaya bölünə bilər, yəni adi PCR, flüoresan kəmiyyət PCR və rəqəmsal PCR.

Adi PCR-nin ilk nəsli

Hədəf geni gücləndirmək üçün adi PCR gücləndirmə alətindən istifadə edin və sonra məhsulu aşkar etmək üçün agaroz gel elektroforezindən istifadə edin, yalnız keyfiyyət analizi edilə bilər.

Birinci nəsil PCR-nin əsas çatışmazlıqları:

-Qeyri-spesifik gücləndirmə və yanlış müsbət nəticələrə meyllidir.

- Aşkarlama uzun çəkir və əməliyyat çətin olur.

-Yalnız keyfiyyət testi edilə bilər.

İkinci nəsil flüoresan kəmiyyət PCR

Floresan kəmiyyət PCR (Real-Time PCR), həmçinin qPCR kimi tanınan, reaksiya sisteminin gedişatını göstərə bilən flüoresan zondlar əlavə etməklə flüoresan siqnalların toplanması yolu ilə gücləndirilmiş məhsulların toplanmasına nəzarət etmək və nəticələri flüoresan əyrisi vasitəsilə mühakimə etmək üçün istifadə olunur və bu, kəmiyyət və standart əyri dəyərinin köməyi ilə edilə bilər.

qPCR texnologiyası qapalı sistemdə həyata keçirildiyi üçün çirklənmə ehtimalı azalır və kəmiyyət aşkarlanması üçün flüoresan siqnalı izlənilə bilir, ona görə də o, klinik praktikada ən geniş istifadə olunur və PCR-də dominant texnologiyaya çevrilib.

Real vaxt rejimində flüoresan kəmiyyət PCR-də istifadə olunan flüoresan maddələr aşağıdakılara bölünə bilər: TaqMan flüoresan zondları, molekulyar mayaklar və flüoresan boyalar.

1) TaqMan flüoresan zond:

PCR gücləndirilməsi zamanı bir cüt primer əlavə edilərkən xüsusi bir flüoresan zond əlavə edilir.Zond bir oliqonukleotiddir və iki ucu müvafiq olaraq müxbir flüoresan qrupu və söndürmə flüoresan qrupu ilə etiketlənir.

Zond bütöv olduqda, reportyor qrupu tərəfindən buraxılan flüoresan siqnal söndürmə qrupu tərəfindən udulur;PCR amplifikasiyası zamanı Taq fermentinin 5′-3′ eksonükleaz aktivliyi probu parçalayır və deqradasiya edir, bu da məruzəçi flüoresan qrupu və söndürücü edir. siqnal tamamilə PCR məhsulunun formalaşması ilə sinxronlaşdırılır.

2) SYBR flüoresan boyalar:

PCR reaksiya sistemində artıq SYBR floresan boyası əlavə edilir.SYBR flüoresan boyası qeyri-spesifik olaraq DNT cüt zəncirinə daxil edildikdən sonra flüoresan siqnal verir.Zəncirə daxil olmayan SYBR boya molekulu heç bir flüoresan siqnal yaymayacaq və bununla da flüoresan siqnalını təmin edəcək. PCR məhsullarının artması PCR məhsullarının artması ilə tamamilə sinxronlaşdırılır.SYBR yalnız ikiqat zəncirli DNT-yə bağlanır, buna görə də ərimə əyrisi PCR reaksiyasının spesifik olub olmadığını müəyyən etmək üçün istifadə edilə bilər.

3) Molekulyar mayaklar

Bu, 5 və 3 uclarında təxminən 8 əsasdan ibarət saç sancağı quruluşunu əmələ gətirən, gövdəli ikiqat etiketli oliqonukleotid zondudur.Hər iki ucundakı nuklein turşusu ardıcıllığı bir-birini tamamlayan şəkildə qoşalaşır, bu da flüoresan qrupunun və söndürmə qrupunun sıx olmasına səbəb olur.Bağlayın, floresan yaratmayacaq.

PCR məhsulu yaradıldıqdan sonra yumşalma prosesi zamanı molekulyar mayakın orta hissəsi xüsusi DNT ardıcıllığı ilə qoşalaşır və flüoresan gen söndürücü gendən flüoresans əmələ gətirmək üçün ayrılır.

İkinci nəsil PCR-nin əsas çatışmazlıqları:

Həssaslıq hələ də yoxdur və aşağı nüsxəli nümunələrin aşkarlanması dəqiq deyil.

Fon dəyəri təsiri var və nəticə müdaxiləyə həssasdır.

Üçüncü nəsil rəqəmsal PCR

Rəqəmsal PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) son nöqtənin aşkarlanması vasitəsilə hədəf ardıcıllığının surət nömrəsini hesablayır və daxili nəzarətlərdən və standart əyrilərdən istifadə etmədən dəqiq mütləq kəmiyyət aşkarlamasını həyata keçirə bilər.

Rəqəmsal PCR son nöqtənin aşkarlanmasından istifadə edir və Ct dəyərindən (dövlət həddi) asılı deyildir, buna görə də rəqəmsal PCR reaksiyası gücləndirmə səmərəliliyindən daha az təsirlənir və PCR reaksiya inhibitorlarına qarşı dözümlülük yüksək dəqiqlik və təkrar istehsal qabiliyyəti ilə təkmilləşdirilir.

Yüksək həssaslıq və yüksək dəqiqlik xüsusiyyətlərinə görə, PCR reaksiya inhibitorları tərəfindən asanlıqla müdaxilə edilmir və tədqiqat və tətbiq qaynar nöqtəsinə çevrilmiş standart məhsullar olmadan əsl mütləq kəmiyyətə nail ola bilir.

Reaksiya vahidinin müxtəlif formalarına görə onu üç növə bölmək olar: mikrofluidik, çip və damcı sistemləri.