qPCR təcrübələrində primer dizaynı da çox vacib bir əlaqədir.Astarların uyğun olub-olmaması gücləndirmə səmərəliliyinin standarta çatması, gücləndirilmiş məhsulların spesifik olub-olmaması və eksperimental nəticələrin mövcud olub-olmaması ilə sıx bağlıdır.
Beləliklə, qPCR primerinin spesifikliyini necə yaxşılaşdırmaq olar?Yüksək gücləndirmə səmərəliliyi?
Bu gün biz sizi birlikdə qPCR primerlərinin layihələndirilməsinə aparacağıq və qPCR primer dizaynının təcrübələrdə səmərəli bilik bacarıqlarına çevrilməsinə icazə verəcəyik.
qPCR primerlərinin layihələndirilməsi zamanı adətən aşağıdakı məqamlara diqqət yetirin: primerlər mümkün qədər intronlar üzrə layihələndirilməli, məhsulun uzunluğu 100-300 bp olmalıdır, Tm dəyəri 60°C-ə mümkün qədər yaxın olmalıdır, yuxarı və aşağı axın primerləri isə mümkün qədər yaxın olmalıdır, astarın sonu isə G və ya C olmalıdır və s.
1. İntronları əhatə edən primerlərin dizaynı
qPCR primerlərinin layihələndirilməsi zamanı intronlar üzrə hazırlanmış primerlərin seçilməsi gDNT şablonunun gücləndirilməsinin qarşısını ala bilər və bütün məhsullar cDNA-nın gücləndirilməsindən əldə edilir, beləliklə, gDNT çirklənməsinin təsirini aradan qaldırır.
2. Astar uzunluğu
Astar uzunluğu ümumiyyətlə 18-30 nt arasındadır və gücləndirici məhsulun uzunluğu mümkün qədər 100-300 bp arasında idarə edilməlidir.
Astar çox qısa olarsa, qeyri-spesifik gücləndirməyə gətirib çıxaracaq və çox uzun olarsa, asanlıqla ikincil struktur meydana gətirəcək (məsələn, saç tıxacının quruluşu).Gücləndirmə məhsulu çox uzun olarsa, polimerazanın reaksiyası üçün uyğun deyil, bu da PCR gücləndirilməsinin səmərəliliyinə təsir edəcəkdir.
3. GC məzmunu və Tm dəyəri
Astarların GC tərkibinə 40% ilə 60% arasında nəzarət edilməlidir.Çox yüksək və ya çox aşağı olarsa, reaksiyanın başlaması üçün əlverişli deyil.Eyni Tm dəyərini və yumşalma temperaturunu əldə etmək üçün irəli və tərs astarların GC tərkibi eyniyə yaxın olmalıdır.
Tm dəyəri mümkün qədər 55-65°C arasında, ümumiyyətlə 60°C ətrafında olmalıdır və yuxarı və aşağı axının Tm dəyəri mümkün qədər yaxın, tercihen 4°C-dən çox olmamalıdır.
4. Astarın 3′ ucunda A seçməkdən çəkinin
Astarın 3′ ucu uyğun gəlmədikdə, müxtəlif əsasların sintez səmərəliliyində böyük fərqlər olur.Son baza A olduqda, hətta uyğunsuzluq vəziyyətində də zəncir sintezini başlada bilər və sonuncu baza T olduqda, uyğunsuzluq induksiyasının səmərəliliyi əhəmiyyətli dərəcədə azalır.Buna görə də, primerin 3′ ucunda A seçməkdən çəkinməyə çalışın və T-ni seçmək daha yaxşıdır.
Əgər bu, zond primeridirsə, zondun 5′ ucu G ola bilməz, çünki hətta tək G bazası FAM flüoresan reportyor qrupuna qoşulduqda, G FAM qrupu tərəfindən buraxılan flüoresan siqnalı da söndürə bilər və nəticədə yanlış mənfi nəticələr yaranır.Görün.
5. Baza paylanması
Dörd əsasın primerdə paylanması tercihen təsadüfi olur, 3′ ucunda 3-dən çox ardıcıl G və ya C-dən və 3-dən çox ardıcıldan qaçır.G və ya C-ni GC ilə zəngin ardıcıllıq bölgəsində cütləşdirmə yaratmaq asandır.
6. Astar dizayn bölgəsi mürəkkəb ikinci dərəcəli strukturlardan qaçınmalıdır.
Amplifikasiya məhsulunun tək zəncirindən əmələ gələn ikincili struktur PCR-nin hamar gedişinə təsir edəcəkdir.Hədəf ardıcıllığında ikinci dərəcəli strukturun olub olmadığını əvvəlcədən təxmin etməklə, primerlərin dizaynında bu bölgədən qaçmağa çalışın.
7. Astarların özləri və astarlar arasında ardıcıl tamamlayıcı əsaslardan qaçmağa çalışmalıdırlar.
Astarın özü ilə primer arasında ardıcıl 4 əsas tamamlayıcılıq ola bilməz.Astarın özü tamamlayıcı ardıcıllığa malik olmamalıdır, əks halda o, astarın və şablonun yumşaldıcı birləşməsinə təsir edəcək bir saç tıxacının quruluşunu yaratmaq üçün özünü qatlayacaqdır.
Upstream və downstream primerlər arasında tamamlayıcı ardıcıllıq mövcud ola bilməz.Primerlər arasında tamamlayıcılıq primer dimerləri istehsal edəcək, bu da PCR səmərəliliyini azaldacaq və hətta kəmiyyət dəqiqliyinə təsir edəcəkdir.Primer-dimer və hairpin strukturları qaçınılmazdırsa, △G dəyəri çox yüksək olmamalıdır (4,5 kkal/mol-dan az olmalıdır).
8. Astarlar hədəf xüsusi məhsulu gücləndirir.
qPCR aşkarlamasının son məqsədi hədəf genin bolluğunu anlamaqdır.Qeyri-spesifik gücləndirmə baş verərsə, kəmiyyət təyini qeyri-dəqiq olacaqdır.Buna görə də, primerlər dizayn edildikdən sonra BLAST tərəfindən sınaqdan keçirilməlidir və məhsulların spesifikliyi ardıcıllıq bazasında müqayisə edilir.
Sonra, qPCR primerlərinin dizaynı üçün nümunə olaraq insan GAS6 (Growth arrest specific 6) genini götürürük.
01 sorğu geni
Homo GAS6NCBI vasitəsilə.Burada gen adı və növlərin ardıcıl olmasını təmin etmək üçün onların müqayisəsinə diqqət yetirməliyik.
02 Gen ardıcıllığını tapın
(1) Hədəf ardıcıllığı genomik DNT-dirsə, genin genomik DNT ardıcıllığı olan birincini seçin.
(2) Hədəf ardıcıllığı mRNA-dırsa, ikincisini seçin.Daxil etdikdən sonra aşağıdakı cədvəldə "CDS" üzərinə klikləyin.Qəhvəyi fon ardıcıllığı genin kodlaşdırma ardıcıllığıdır.
03 Dizayn astarları
Primer-BLAST interfeysinə daxil olun
Yuxarı solda gen sıra nömrəsini və ya ardıcıllığı Fasta formatında daxil edin və müvafiq parametrləri doldurun.

"Praymerləri əldə et" düyməsini klikləyin və NCBI sizə bu cür parametr seçiminin digər əlavə variantlarına gücləndiriləcəyini bildirmək üçün açılacaq.Biz müxtəlif əlavə variantlarını yoxlaya və müvafiq primer cütünü əldə etmək üçün onları təqdim edə bilərik (aşağıdakı şəkildə göstərildiyi kimi).Bu prosesin icrası on saniyə çəkə bilər.
Bu primer cütlərinin yumşalma temperaturu təxminən 60°C-dir.Təcrübənin məqsədinə uyğun olaraq, təcrübə üçün orta uzunluqlu, yaxşı spesifiklik və daha az özünü tamamlayan primerləri seçin və müvəffəqiyyət dərəcəsi kifayət qədər yüksəkdir!
04 Primer spesifikliyinin yoxlanılması
Əslində, Primer-Blast astarların dizaynı ilə yanaşı, özümüz hazırladığımız primerləri də qiymətləndirə bilər.Astar dizayn səhifəsinə qayıdın, dizayn etdiyimiz yuxarı və aşağı axın primerlərini daxil edin və digər parametrlər düzəldilməyəcək.Təqdim etdikdən sonra siz primer cütünün digər genlərdə də olub-olmadığını görə bilərsiniz.Hamısı gen üzərində göstərilibsə, gücləndirmək istəyirik, bu, bu cüt primerlərin spesifikliyinin böyük olduğunu göstərir!(Məsələn, bu, ilkin sorğunun yeganə nəticəsidir!)

05 Primer keyfiyyətinə dair mühakimə
“Standara qədər gücləndirmə səmərəliliyi”, “gücləndirilmiş məhsul xüsusiyyətləri” və “etibarlı eksperimental nəticələri” birləşdirən “mükəmməl” primer hansı növ primerdir?
Gücləndirmə səmərəliliyi

ərimə əyrisi
Primerlərin gücləndirmə effektivliyi 90%-110%-ə çatır, bu o deməkdir ki, gücləndirmə səmərəliliyi yaxşıdır və ərimə əyrisi tək pikə malikdir və adətən Tm>80°C-dir, bu da gücləndirmə spesifikliyinin yaxşı olması deməkdir.
 
Əlaqədar məhsullar:
Real Time PCR Easy – SYBR GREEN I
Real Time PCR Easy-Taqman