Floresan kəmiyyət PCR (həmçinin TaqMan PCR, bundan sonra FQ-PCR kimi tanınır) 1995-ci ildə ABŞ-da PE (Perkin Elmer) tərəfindən hazırlanmış yeni nuklein turşusu kəmiyyət texnologiyasıdır. Bu texnologiya flüoresan etiketli zondlar əlavə etməklə adi PCR-ə əsaslanır.Çevik PCR ilə müqayisədə FQ-PCR öz kəmiyyət funksiyasını həyata keçirmək üçün bir çox üstünlüklərə malikdir.Bu məqalə texnologiyanın xüsusiyyətlərini, prinsiplərini, metodlarını və tətbiqlərini qısaca təsvir etmək niyyətindədir.
1 Xüsusiyyətlər
FQ-PCR nəinki adi PCR-in yüksək həssaslığına malikdir, həm də flüoresan zondların tətbiqi sayəsində o, adi PCR-in bir çox çatışmazlıqlarını aradan qaldıran kəmiyyət nəticələr əldə etmək üçün fotoelektrik keçirici sistem vasitəsilə PCR gücləndirilməsi zamanı flüoresan siqnalın dəyişməsini bilavasitə aşkar edə bilir, buna görə də DNT-nin yüksək spesifikliyinə və yüksək spesifikasiyaya malikdir.
Məsələn, ümumi PZR məhsulları agaroz gel elektroforezi və ultrabənövşəyi şüa ilə etidium bromid boyası və ya poliakrilamid gel elektroforezi və gümüşün boyanması ilə müşahidə edilməlidir.Bu, yalnız bir çox alət tələb etmir, həm də vaxt və səy tələb edir.Etidium bromide istifadə edilən ləkələr insan orqanizmi üçün zərərlidir və bu mürəkkəb eksperimental prosedurlar çirklənmə və yanlış pozitivlər üçün imkanlar yaradır.Bununla belə, FQ-PCR nümunənin yüklənməsi zamanı yalnız bir dəfə qapağı açmalıdır və sonrakı proses tamamilə qapalı boru əməliyyatıdır ki, bu da PCR-dən sonrakı emal tələb etmir, adi PCR əməliyyatlarında bir çox çatışmazlıqlardan qaçır.Təcrübədə ümumiyyətlə PE şirkəti tərəfindən hazırlanmış ABI7100 PCR termal siklatorundan istifadə olunur.
Alət aşağıdakı xüsusiyyətlərə malikdir: ① Geniş tətbiq: O, DNT və RNT PCR məhsulunun kəmiyyətinin müəyyən edilməsi, gen ifadəsinin tədqiqi, patogen aşkarlanması və PCR şəraitinin optimallaşdırılması üçün istifadə edilə bilər.② Unikal kəmiyyət prinsipi: Flüoresan etiketli zondlardan istifadə edərək, kəmiyyətin təyin edilməsi məqsədinə nail olmaq üçün flüoresans miqdarı lazer həyəcanından sonra PCR dövrü ilə toplanacaq.③ Yüksək iş səmərəliliyi: Quraşdırılmış 9600 PCR termal siklator, 96 nümunənin gücləndirilməsini və kəmiyyətini avtomatik və sinxron şəkildə başa çatdırmaq üçün 1 ilə 2 saata qədər kompüter idarə olunur.④ Gel elektroforezinə ehtiyac yoxdur: Nümunəni seyreltməyə və elektroforez etməyə ehtiyac yoxdur, sadəcə reaksiya borusunda birbaşa aşkar etmək üçün xüsusi zonddan istifadə edin.⑤Boru kəmərində çirklənmə yoxdur: Unikal tam qapalı reaksiya borusu və fotoelektrik keçirici sistem qəbul edilib, ona görə də çirklənmədən narahat olmağa ehtiyac yoxdur.⑥Nəticələr təkrarlana bilir: kəmiyyət dinamik diapazonu beş dərəcəyə qədərdir.Buna görə də, bu texnologiya uğurla inkişaf etdirildiyi üçün bir çox elmi tədqiqatçılar tərəfindən qiymətləndirilmiş və bir çox sahələrdə tətbiq edilmişdir.
2 Prinsiplər və üsullar
FQ-PCR-nin iş prinsipi PCR reaksiya sisteminə floresan etiketli zond əlavə etmək üçün Taq fermentinin 5′→3′ eksonükleaz aktivliyindən istifadə etməkdir.Zond xüsusi olaraq primer ardıcıllığında olan DNT şablonu ilə hibridləşə bilər.Zondun 5′ ucu flüoresan emissiya geni FAM (6-karboksiflüoresan, 518nm-də flüoresan emissiya zirvəsi) ilə, 3′ucu isə flüoresan söndürmə qrupu TAMRA (6-karboksitetrametilrodamin, flüoresans emissiyası 518 nm) ilə etiketlənir. PCR gücləndirilməsi zamanı zondun uzadılmasının qarşısını almaq üçün fosforlanmışdır.Zond toxunulmaz qaldıqda, söndürmə qrupu emissiya qrupunun flüoresan emissiyasını boğur.Emissiya qrupu söndürmə qrupundan ayrıldıqdan sonra inhibə qaldırılır və 518 nm-də optik sıxlıq artır və flüoresan aşkarlama sistemi tərəfindən aşkar edilir. Renaturasiya mərhələsində zond şablon DNT ilə hibridləşir və uzadılma mərhələsindəki Taq fermenti DNT-nin uzantısı ilə birlikdə hərəkət edir.Zond kəsildikdə söndürmə effekti buraxılır və flüoresan siqnal buraxılır.Şablon hər dəfə kopyalandıqda, flüoresan siqnalın buraxılması ilə müşayiət olunan zond kəsilir.Buraxılan flüoroforların sayı ilə PCR məhsullarının sayı arasında bir-bir əlaqə olduğundan, bu texnikadan şablonun kəmiyyətini dəqiq müəyyən etmək üçün istifadə oluna bilər.Eksperimental alət ümumiyyətlə PE şirkəti tərəfindən hazırlanmış ABI7100 PCR termal siklatorundan istifadə edir və digər istilik dövrəçiləri də istifadə edilə bilər.Təcrübə üçün ABI7700 reaksiya tipli reaksiya sistemindən istifadə edilərsə, reaksiya başa çatdıqdan sonra kəmiyyət nəticələri birbaşa kompüter analizi vasitəsilə verilə bilər.Digər istilik dövrələyicilərindən istifadə edirsinizsə, RQ+, RQ-, △RQ hesablamaq üçün eyni zamanda reaksiya borusunda flüoresan siqnalını ölçmək üçün flüoresan detektorundan istifadə etməlisiniz.RQ+ nümunə borusunun flüoresan emissiya qrupunun lüminesans intensivliyinin söndürmə qrupunun lüminesans intensivliyinə nisbətini, RQ- boş borudakı ikisinin nisbətini təmsil edir, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) flüoresans prosesi zamanı əldə edilə bilən flüoresan məlumatların miqdarını təmsil edir.Floresan zondların tətbiqi sayəsində təcrübənin spesifikliyi əhəmiyyətli dərəcədə yaxşılaşdırılır.Zond dizaynı ümumiyyətlə aşağıdakı şərtlərə cavab verməlidir: ①Bağlamanın spesifikliyini təmin etmək üçün zondun uzunluğu təxminən 20-40 əsas olmalıdır.②Tək nukleotid ardıcıllığının təkrarlanmasının qarşısını almaq üçün GC əsaslarının tərkibi 40% ilə 60% arasındadır.③ Hibridləşmədən və ya primerlərlə üst-üstə düşmədən çəkinin.④ Zond ilə şablon arasındakı bağlanmanın dayanıqlığı primer və şablon arasındakı bağlanmanın dayanıqlığından böyükdür, ona görə də zondun Tm dəyəri astarın Tm dəyərindən ən azı 5°C yüksək olmalıdır.Bundan əlavə, zondun konsentrasiyası, zond və şablon ardıcıllığı arasındakı homologiya və zond ilə primer arasındakı məsafə eksperimental nəticələrə təsir göstərir.
Əlaqədar məhsullar:
Çin Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman İstehsalçı və Təchizatçı |Foregene (foreivd.com)
Göndərmə vaxtı: 15 oktyabr 2021-ci il
