Birbaşa PCR, nuklein turşusu ekstraktı olmadan gücləndirmək üçün birbaşa heyvan və ya bitki toxumalarından istifadə edən bir reaksiyadır.Bir çox cəhətdən birbaşa PCR adi PCR kimi işləyir

Əsas fərq, birbaşa PCR-də istifadə olunan xüsusi tampondur, nümunə nuklein turşusu ekstraktı olmadan birbaşa PCR reaksiyasına məruz qala bilər, lakin fermentlərin tolerantlığı və birbaşa PCR reaksiyasında iştirak edən tamponun uyğunluğu üçün müvafiq tələblər var.

Ümumi nümunələrdə az və ya çox PCR inhibitorları olmasına baxmayaraq, birbaşa PCR hələ də fermentlərin və tamponların təsiri altında etibarlı gücləndirməyə nail ola bilər.Ənənəvi PCR reaksiyası şablon kimi yüksək keyfiyyətli nuklein turşusu tələb edir, əgər şablonda zülallar və digər çirklər varsa, PCR reaksiyasının rəvan gedişini maneə törədə bilər.Birbaşa PCR hazırda molekulyar diaqnostika sahəsində ən populyar texnologiyalardan biridir.

01 Direct PCR əvvəlcə heyvan və bitki üçün istifadə edilmişdir

Birbaşa PZR-in ən erkən tətbiqi heyvan və bitkilər sahəsində, məsələn, siçovul, pişik, toyuq, dovşan, qoyun, mal-qara və s.-nin qanı, toxuması və tükləri, bitki yarpaqları və toxumları və s., genotipləşdirmə, transgenik, plazmid aşkarlanması, Gen nokaut analizi, DNT mənbəyinin identifikasiyası, növlərin identifikasiyası və digər sahələrdə istifadə olunur.

Bu sahələr bəzi ümumi xüsusiyyətlərə malikdir, yəni hədəf gen tərkibi nisbətən yüksəkdir və nuklein turşusunun çıxarılması problemlidir, buna görə də birbaşa PCR nəinki vaxta qənaət edə və nəticələrə kiçik təsir göstərə bilər, həm də xərclərə qənaət edə bilər.

Patojenin aşkarlanması üçün istifadə edilən birbaşa PCR son illərin məsələsidir, bəzi PCR reagent istehsalçıları yenilik edərkən bu istiqamətdə çox səy göstərmişlər.Xüsusilə bu COVID-19 epidemiyasında bazarda bir çox belə aşkarlama məhsulları ortaya çıxdı, məsələn, Foregene tərəfindən tədqiq edilmiş və işlənmiş SARS-CoV-2 Nuklein Turşusu Təsbit Dəsti (Multiplex PCR Flüoresan Prob Metod), insan 2-burun turşusunun və ya SARS-2-də nüvə turşusunun keyfiyyətcə aşkarlanması üçün Real-time RT PCR texnologiyasından (rRT-PCR) istifadə edir. qaringeal tampon nümunələri.

Foregene normal ORF1ab, N, E vəvariant SARS-CoV-2 B.1.1.7 lineage (Böyük Britaniya), B.1.351 lineage (ZA), B.1.617 lineage (IND) və P.1 lineage (BR) kimi insan nazofarengeal və ya orofaringeal tampon nümunələrindəki nüklein turşularının nəsilləri.

02  Birbaşa PCR üçün lazım olan reagentlər

Lizat nümunəsi

Nümunə lizatını özünüz konfiqurasiya edə və ya satın ala bilərsiniz.Fərqli marka lizatların tərkibindəki fərq lizinq qabiliyyətini fərqli edəcək və sonra lizinq vaxtı bir qədər fərqli olacaq.Məsələn, heyvan toxuması nümunələrinin hazırlanması üçün ümumiyyətlə 30 dəqiqə və ya bir gecədə lizis tövsiyə olunur və viruslar üçün lizis məhlulu 3-10 dəqiqə arasında dəyişir.

PCR master qarışığı

Xüsusi gücləndirməni artırmaq və gücləndirmə qabiliyyətini artırmaq üçün isti başlanğıc DNT polimerazından istifadə etmək tövsiyə olunur.Birbaşa PCR-in nüvəsi yüksək tolerant polimerazadır.

Nümunədə DNT gücləndirilməsinə təsir edən komponentləri aradan qaldırın və ya inhibə edin

Nümunə lizat, zülallar, lipidlər və digər hüceyrə qalıqları ilə emal edildikdən sonra bu maddələr PCR reaksiyasını maneə törədəcək.Buna görə də, birbaşa PCR bu amillərin təsirini azaltmaq üçün müvafiq aradan qaldırılması və ya inhibitorlarının əlavə edilməsini tələb edir.

03  Birbaşa PCR-in beş bilik nöqtəsi toplusu

Birincisi, Direct PCR texnologiyası müxtəlif bioloji nümunələr üçün birbaşa PCR texnologiyasıdır.Bu texniki şəraitdə PCR reaksiyasını yerinə yetirmək üçün nuklein turşusunun ayrılması və çıxarılması, birbaşa toxuma nümunəsindən obyekt kimi istifadə edilməsi və hədəf gen primerlərinin əlavə edilməsinə ehtiyac yoxdur.

İkincisi, Direct PCR texnologiyası yalnız ənənəvi DNT şablon gücləndirmə texnologiyası deyil, həm də RNT şablonunun əks transkripsiya PZR-ni ehtiva edir.

Üçüncüsü, Direct PCR texnologiyası təkcə birbaşa olaraq toxuma nümunələri üzərində müntəzəm keyfiyyətli PCR reaksiyalarını yerinə yetirmir, həm də reaksiya sisteminin güclü fon əleyhinə flüoresan müdaxilə qabiliyyətinə malik olmasını tələb edən Real-Time qPCR reaksiyalarını da əhatə edir və endogen flüoresans antaqonist qabiliyyəti söndürür.

Dördüncüsü, Direct PCR texnologiyası ilə hədəflənmiş nümunələr yalnız nuklein turşusu şablonlarının buraxılmasına ehtiyac duyur və PCR reaksiyasına mane olan zülalları, polisaxaridləri, duz ionlarını və s.Hansı ki, reaksiya sistemində olan nuklein turşusu polimeraza və PCR Qarışıqının mürəkkəb şəraitdə ferment aktivliyini və replikasiya dəqiqliyini təmin etmək üçün əla müqavimətə və uyğunlaşma qabiliyyətinə malik olmasını tələb edir.

Beşincisi, heç bir nuklein turşusu zənginləşdirmə müalicəsi olmadan Direct PCR texnologiyası ilə hədəflənmiş toxuma nümunəsi və şablonun miqdarı çox kiçikdir, bu da reaksiya sisteminin son dərəcə yüksək həssaslığa və gücləndirmə səmərəliliyinə malik olmasını tələb edir.