İnanıram ki, hər kəs PCR reaksiyalarını həyata keçirərkən həmişə bu və ya digər problemlərlə qarşılaşacaq, lakin onların əksəriyyətini iki əsas problemə bölmək olar:

Gen şablonunun çox az gücləndirilməsi (amplifikasiya);
Həddən artıq qeyri-hədəf gen gücləndirilməsi.
Əlavələrdən istifadə bu problemləri həll etmək üçün ümumi strategiyalardan biridir.Adətən əlavələrin rolunun iki aspekti var:
ikinci dərəcəli quruluşgenlərin (ikinci dərəcəli quruluşu);
Qeyri-spesifik astarlamağı azaldın.
Bu gün redaktor sizə PCR reaksiyalarında ümumi əlavələr və onların funksiyaları ilə qısaca tanış edəcək.
İkinci dərəcəli quruluşu azaldan əlavələr
sulfoksid(DMSO)
gen nümunələriyüksək GC məzmunu ilə.Bununla belə, DMSO Taq polimeraz fəaliyyətini də xeyli azaldır.Buna görə də, hər kəs şablonun əlçatanlığını və polimerazın aktivliyini balanslaşdırmalıdır.Redaktor təklif edir ki, təcrübənizə uyğun konsentrasiyanı tapmaq üçün DSMO-nun müxtəlif konsentrasiyalarını, məsələn, 2%-dən 10%-ə qədər cəhd edə bilərsiniz.
Qeyri-ion yuyucu vasitələr
0,1-1% Triton X-100, Tween 20 və ya NP-40 kimi qeyri-ion yuyucu vasitələr adətən DNT-nin ikincil strukturunu azaldır.Bu, şablon geninin gücləndirilməsini artıra bilsə də, qeyri-spesifik gücləndirmə probleminə də səbəb olacaq.Beləliklə, bu əlavələr zibil olmadan aşağı məhsuldar PCR reaksiyaları üçün yaxşı işləyir, lakin nisbətən təmiz olmayan PRC reaksiyaları üçün o qədər də yaxşı deyil.Qeyri-ion yuyucu vasitələrin başqa bir üstünlüyü SDS ilə çirklənmənin azalmasıdır.Adətən DNT ekstraksiya prosesi zamanı SDS polimerazanın fəaliyyətini böyük dərəcədə maneə törədən PCR mərhələsinə gətiriləcək.Buna görə də reaksiyaya 0,5% Tween-20 və ya Tween-40 əlavə etmək SDS-nin mənfi təsirlərini neytrallaşdıra bilər.
betain_
Betain, ikincil struktur formalaşmasını azaltmaqla DNT gücləndirilməsini yaxşılaşdıra bilər və ümumiyyətlə kommersiya PCR dəstlərinə "sirr" əlavədir.Betain istifadə etmək istəyirsinizsə, betain və ya betain mono-hidrat (Betain və ya Betain mono-hidrat) qoymalısınız, lakin betain hidroxlorid (Betain HCl) deyil, 1-1.7M son konsentrasiyasına uyğunlaşın.Betain həmçinin spesifikliyi yaxşılaşdırmağa kömək edə bilər, çünki o, DNT əriməsinin/DNT denaturasiyasının əsas cüt tərkibindən asılılığını aradan qaldırır.
Qeyri-spesifik astarlanmanı azaltmaq üçün əlavələr
Formamid
Formamid çox istifadə edilən üzvi PCR əlavəsidir.O, DNT-də əsas yiv və kiçik yivlə birləşə bilər, bununla da master DNT ikiqat spiralının sabitliyini azaldır və DNT-nin ərimə temperaturunu aşağı salır.PCR təcrübələrində istifadə olunan formamidin konsentrasiyası adətən 1%-5% təşkil edir.
tetrametilammonium xlorid( TMAC)
Tetrametilamonium xlorid hibridləşmənin spesifikliyini (hibridləşmə spesifikliyini) artıra və DNT-nin ərimə temperaturunu artıra bilər.Beləliklə, TMAC qeyri-spesifik priminqi aradan qaldıra və DNT və RNT-nin yanlış bağlanmasını azalda bilər.İstifadə etsənizdegenerativ primerlərPCR reaksiyasında adətən 15-100 mM konsentrasiyada istifadə olunan TMAC əlavə etməyi unutmayın.
Digər Ümumi Əlavələr
Yuxarıda qeyd olunan iki kateqoriyalı aşqarlardan əlavə, PZR reaksiyalarında çoxlu ümumi aşqarlar var, onların müxtəlif funksiyaları olsa da, onlar da çox vacibdir.
Maqnezium ionu
Maqnezium ionu polimerazanın əvəzsiz kofaktorudur (kofaktorudur), yəni maqnezium ionu olmadan polimeraza qeyri-aktivdir.Bununla belə, çoxlu maqnezium ionları da polimerazın effektivliyinə təsir göstərə bilər.Hər bir PCR reaksiyasında maqnezium ionlarının konsentrasiyası fərqli olacaq.Xelatlaşdırıcı maddələr (EDTA və ya sitrat kimi), dNTP-lərin və zülalların konsentrasiyası maqnezium ionlarının konsentrasiyasına təsir göstərir.Beləliklə, PCR təcrübənizlə bağlı probleminiz varsa, müxtəlif maqnezium ionlarının konsentrasiyalarını, məsələn, 0,5-1 mM interval ilə 1,0-dan 4,0 mM-ə dəyişdirməyə cəhd edə bilərsiniz.
Qeyd etmək lazımdır ki, çoxlu donma-ərimə dövrləri maqnezium xlorid məhlulunun konsentrasiyasının təbəqələşməsinə səbəb ola bilər.Buna görə də hər istifadədən əvvəl onu tamamilə həll etməli və istifadə etməzdən əvvəl yaxşıca qarışdırmalısınız.
İnək serum albumini(Bovine albumin, BSA)
Molekulyar kimya təcrübələrində iribuynuzlu zərdab albumini xüsusilə məhdudlaşdırıcı ferment həzmində və PCR təcrübələrində çox yayılmış əlavədir.PCR reaksiyalarında BSA, fenolik birləşmələr kimi çirkləndiricilərin azaldılmasında faydalıdır.Həm də deyilir ki, reaktivlərin sınaq borusunun divarına yapışmasını azalda bilər.PCR reaksiyasında adətən əlavə edilən BSA-nın konsentrasiyası 0,8 mq/ml-ə çata bilər.
 
Əlaqədar məhsullar:
PCR Qəhrəmanı(boya ilə)
PCR Qəhrəmanı