PZR reagentlərinin ilkin mərhələsində primerlərin və zondların performansının yoxlanılması və ən uyğun reaksiya şəraitinin müəyyən edilməsi formal təcrübələrin rahat gedişatını təmin etmək üçün ilkin şərtlərdir.
Beləliklə, ilkin mərhələdə primer zondunu necə təsdiqləməliyik?
Əsas göstəricilər baza, gücləndirmə əyrisi, ct dəyəri, gücləndirmə səmərəliliyi, aşağı konsentrasiyalı nümunənin aşkarlanması, CV və s.
Əsas xətt
Əsas xətt PCR gücləndirmə əyrisindəki üfüqi xəttdir.PCR gücləndirmə reaksiyasının ilk bir neçə dövründə flüoresan siqnalı çox dəyişmir və düz xətt təşkil edir.Bu düz xətt əsasdır.
PCR primer zondlarını yoxlayarkən, əsas xəttin səviyyəli olub-olmamasına diqqət yetirin.Primer zondu konsentrasiyasının təmizliyi baza səviyyəsinə təsir edəcək, məsələn, baza xəttinin yüksəlməsinə və ya azalmasına səbəb olacaq.Əsas göstərici də çox intuitiv göstəricidir.
Gücləndirmə əyrisi
Başqa bir intuitiv göstərici gücləndirmə əyrisinin formasıdır.İkincil gücləndirmə və ya digər anormal gücləndirmə əyrilərinin qarşısını almaq üçün S-formalı əyriyə sahib olmaq ən yaxşısıdır.
Ct Dəyəri
Əsas xəttdən eksponensial artıma qədər əyilmə nöqtəsinə uyğun gələn dövrlərin sayı Ct dəyəridir.
Eyni nümunə üçün müxtəlif primer zondları müxtəlif gücləndirmə əyriləri ilə nəticələnir və müvafiq Ct dəyəri gücləndirmə səmərəliliyi və müdaxilə dərəcəsindən təsirlənəcəkdir.Teorik olaraq, seçdiyimiz primer zondunun Ct dəyəri nə qədər kiçik olsa, bir o qədər yaxşıdır.
Gücləndirmə Effektivliyi
PCR gücləndirmə effektivliyini qiymətləndirmək üçün ən etibarlı və sabit üsullardan biri də tədqiqatçılar tərəfindən geniş şəkildə tanınan standart əyridir.Metod hədəf şablonların nisbi sayına nəzarət etmək üçün bir sıra nümunələr hazırlamağı nəzərdə tutur.Bu nümunələr adətən konsentratlı məhlulların ardıcıl seyreltmələri ilə hazırlanır, ən çox istifadə edilən 10 qat qatılmadır.Bir sıra seyreltilmiş nümunələrdən istifadə edərək, gücləndirmək üçün standart qPCR proqramından istifadə edərək Cq dəyərini əldə edin və nəhayət Cq= -klgX0+b xətti tənliyini və E=10(-1 /k)-1 gücləndirmə səmərəliliyini əldə etmək üçün hər bir nümunənin konsentrasiyasına və müvafiq Cq dəyərinə uyğun standart əyri çəkin.Kəmiyyət analizi üçün qPCR istifadə edərkən, gücləndirmə səmərəliliyinin 90%-110% (3.6>k>3.1) diapazonunda olması tələb olunur.
Aşağı konsentrasiyalı nümunələrin aşkarlanması
Nümunə konsentrasiyası aşağı olduqda, müxtəlif primer zondlarının aşkarlama dərəcələri fərqlidir.Biz təkrarlamaq üçün 20 aşağı konsentrasiyalı nümunə seçirik və ən yüksək aşkarlama sürətinə malik primer-zond sistemi ən yaxşısıdır.
Dəyişiklik əmsalı (CV)
Nuklein turşusunun gücləndirilməsinin aşkarlanması üçün reagentin xətt standartına uyğun olaraq müxtəlif primer zondları ilə 10 dublikat nümunə aşkar edilə bilər.
Kəmiyyət reagentləri:
Dəqiqlik
Bir partiya daxilində dəqiqlik cavab verməlidir: sınaq konsentrasiyasının loqarifmik dəyərinin dəyişmə əmsalı (CV,%) ≤5% təşkil edir.Nümunənin konsentrasiyası aşağı olduqda, aşkarlama konsentrasiyasının loqarifminin dəyişmə əmsalı (CV,%) ≤10% təşkil edir.
Keyfiyyətli reagentlər:
Dəqiqlik
Bir partiyada dəqiqlik aşağıdakılara cavab verməlidir:
(1) Ct dəyərinin dəyişmə əmsalı (CV,%) ≤5%
Eyni nümunə paralel olaraq 10 dəfə sınaqdan keçirilir və test nəticələri ardıcıl olmalıdır
Göndərmə vaxtı: 18 sentyabr 2021-ci il
