• PCR az miqdarda DNT şablonundan DNT-ni gücləndirmək üçün istifadə edilən bir üsuldur.RT-PCR, daha sonra gücləndirilə bilən bir RNT mənbəyindən bir DNT şablonu yaratmaq üçün əks transkripsiyadan istifadə edir.
• PCR və RT-PCR adətən son nöqtə reaksiyalarıdır, qPCR və RT-qPCR isə mövcud şablonun miqdarını ölçmək üçün PCR reaksiyası zamanı məhsul sintezi sürətinin kinetikasından istifadə edir.
• Rəqəmsal PCR kimi daha yeni üsullar ilkin DNT şablonunun mütləq kəmiyyətini təmin edir, izotermik PCR kimi üsullar isə etibarlı nəticələr əldə etmək üçün bahalı avadanlıqlara ehtiyacı azaldır.

Polimeraza zəncirvari reaksiya (PZR) DNT və RNT ardıcıllığını gücləndirmək və aşkar etmək üçün nisbətən sadə və geniş istifadə olunan molekulyar biologiya üsuludur.Çox vaxt günlər çəkə bilən DNT klonlaşdırılması və gücləndirilməsinin ənənəvi üsulları ilə müqayisədə PCR yalnız bir neçə saat tələb edir.PCR yüksək həssasdır və xüsusi ardıcıllığın aşkarlanması və gücləndirilməsi üçün minimal şablon tələb edir.Əsas PCR üsulları sadə DNT və RNT aşkarlanmasından daha da inkişaf etmişdir.Aşağıda, tədqiqat ehtiyaclarınız üçün Enzo Life Sciences-da təqdim etdiyimiz müxtəlif PCR üsulları və reagentlər haqqında ümumi məlumat vermişik.Biz alimlərə növbəti tədqiqat layihələrində istifadə etmək üçün PCR reagentlərinə tez daxil olmaqda kömək etməyi hədəfləyirik!

PCR

Standart PCR üçün sizə lazım olan tək şey DNT polimeraza, maqnezium, nukleotidlər, primerlər, gücləndiriləcək DNT şablonu və termocyclerdır.PCR mexanizmi məqsədi qədər sadədir: 1) ikiqat zəncirli DNT (dsDNA) istiliklə denatürasiya olunur, 2) primerlər tək DNT zəncirlərinə uyğunlaşır və 3) primerlər DNT polimeraza tərəfindən uzadılır, nəticədə DNT-nin iki nüsxəsi yaranır. orijinal DNT ipi.Bir sıra temperatur və vaxtlar ərzində denaturasiya, yumşalma və uzanma prosesi bir gücləndirmə dövrü kimi tanınır (şək. 1).

Dövrün hər bir addımı istifadə olunan şablon və primer dəsti üçün optimallaşdırılmalıdır.Bu dövr təxminən 20-40 dəfə təkrarlanır və gücləndirilmiş məhsul daha sonra adətən agaroz gel ilə təhlil edilə bilər (Şəkil 2).

PCR yüksək həssas üsul olduğundan və tək reaksiyalar üçün çox kiçik həcmlər tələb olunduğundan, bir neçə reaksiya üçün əsas qarışığın hazırlanması tövsiyə olunur.Əsas qarışıq yaxşıca qarışdırılmalı və sonra reaksiyaların sayına görə bölünməlidir ki, hər bir reaksiya eyni miqdarda ferment, dNTP və primerlərdən ibarət olacaq.Enzo Life Sciences kimi bir çox təchizatçı, həmçinin primerlərdən və DNT şablonundan başqa hər şeyi ehtiva edən PCR qarışıqları təklif edir.

Guanin/Sitozinlə zəngin (GC-zəngin) bölgələr standart PCR üsullarında problem yaradır.GC ilə zəngin ardıcıllıqlar aşağı GC məzmunlu ardıcıllıqlardan daha sabitdir.Bundan əlavə, GC ilə zəngin ardıcıllıqlar saç tıxacları kimi ikinci dərəcəli strukturlar əmələ gətirir.Nəticədə, denaturasiya fazası zamanı GC ilə zəngin ikiqat telləri tamamilə ayırmaq çətindir.Nəticədə, DNT polimeraza maneəsiz yeni zəncir sintez edə bilməz.Daha yüksək denatürasiya temperaturu bunu yaxşılaşdıra bilər və daha yüksək yumşalma temperaturu və daha qısa tavlama müddətinə doğru düzəlişlər GC ilə zəngin primerlərin qeyri-spesifik bağlanmasının qarşısını ala bilər.Əlavə reagentlər GC ilə zəngin ardıcıllığın gücləndirilməsini gücləndirə bilər.DMSO, qliserin və betain, GC qarşılıqlı təsirindən yaranan ikinci dərəcəli strukturları pozmağa kömək edir və bununla da ikiqat iplərin ayrılmasını asanlaşdırır.

İsti başlanğıc PCR

Qeyri-spesifik gücləndirmə PCR zamanı baş verə biləcək bir problemdir.PCR üçün istifadə edilən DNT polimerazalarının əksəriyyəti 68°C ilə 72°C arasında olan temperaturda ən yaxşı şəkildə işləyir.Bununla belə, ferment daha aşağı dərəcədə olsa da, aşağı temperaturda da aktiv ola bilər.Yuvlama temperaturundan çox aşağı temperaturlarda, reaksiya buz üzərində qurulsa belə, primerlər qeyri-spesifik şəkildə bağlana və qeyri-spesifik gücləndirməyə səbəb ola bilər.Bunun qarşısını yalnız müəyyən bir temperatura çatdıqdan sonra DNT polimerazadan ayrılan polimeraza inhibitorlarından istifadə etməklə almaq olar, buna görə də isti başlanğıc PCR termini.İnhibitor ilkin denaturasiya temperaturunda (adətən 95°C) polimerazanı bağlayan və denatürasiya edən antikor ola bilər.

Yüksək sədaqətli polimeraza

DNT polimerazları orijinal şablon ardıcıllığına kifayət qədər dəqiq şəkildə gücləndirilsə də, nukleotidlərin uyğunlaşdırılmasında səhvlər baş verə bilər.Klonlaşdırma kimi tətbiqlərdəki uyğunsuzluqlar transkriptlərin kəsilməsinə və aşağı axınında səhv tərcümə edilmiş və ya qeyri-aktiv zülallara səbəb ola bilər.Bu uyğunsuzluqların qarşısını almaq üçün “korreksiya” fəaliyyətinə malik polimerazlar müəyyən edilib və iş prosesinə daxil edilib.İlk korrektor polimeraza, Pfu, 1991-ci ildə Pyrococcus furiosus-da müəyyən edilmişdir.Bu Pfu fermenti 3'-dən 5'ə qədər eksonükleaz aktivliyinə malikdir.DNT gücləndirildikdə, ekzonükleaza ipin 3' ucunda uyğun olmayan nukleotidləri çıxarır.Daha sonra düzgün nukleotid dəyişdirilir və DNT sintezi davam edir.Yanlış nukleotid ardıcıllığının müəyyən edilməsi düzgün nukleozid trifosfat üçün fermentlə bağlanma yaxınlığına əsaslanır, burada səmərəsiz bağlanma sintezi ləngidir və düzgün əvəzlənməyə imkan verir.Pfu polimerazının korrektura fəaliyyəti Taq DNT polimerazası ilə müqayisədə son ardıcıllıqda daha az səhvlə nəticələnir.Son illərdə digər korrektor fermentləri müəyyən edilmişdir və DNT-nin gücləndirilməsi zamanı səhv nisbətini daha da azaltmaq üçün orijinal Pfu fermentinin modifikasiyası edilmişdir.

RT-PCR

Əks transkripsiya PCR və ya RT-PCR, RNT-nin şablon kimi istifadəsinə imkan verir.Əlavə bir addım RNT-nin aşkarlanmasına və gücləndirilməsinə imkan verir.RNT əks transkriptazdan istifadə edərək tamamlayıcı DNT-yə (cDNA) əks transkripsiya edilir.RNT şablonunun keyfiyyəti və təmizliyi RT-PCR-nin müvəffəqiyyəti üçün vacibdir.RT-PCR-nin ilk addımı DNT/RNT hibridinin sintezidir.Əks transkriptaza həmçinin hibridin RNT hissəsini deqradasiya edən RNase H funksiyasına malikdir.Tək zəncirli DNT molekulu daha sonra cDNA-ya əks transkriptazın DNT-dən asılı DNT polimeraz fəaliyyəti ilə tamamlanır.Birinci zəncir reaksiyasının səmərəliliyi gücləndirmə prosesinə təsir göstərə bilər.Buradan cDNA-nı gücləndirmək üçün standart PCR proseduru istifadə olunur.RT-PCR ilə RNT-ni cDNT-yə qaytarmaq imkanı bir çox üstünlüklərə malikdir və o, ilk növbədə gen ifadə analizi üçün istifadə olunur.RNT tək zəncirlidir və çox qeyri-sabitdir, bu da onunla işləməyi çətinləşdirir.O, adətən bioloji nümunədə RNT transkriptlərinin miqdarını təyin edən qPCR-də ilk addım kimi xidmət edir.

qPCR və RT-qPCR

Kəmiyyət PCR (qPCR) çoxsaylı tətbiqlər üçün nuklein turşularını aşkar etmək, xarakterizə etmək və kəmiyyətini təyin etmək üçün istifadə olunur.RT-qPCR-də RNT transkriptləri tez-tez yuxarıda təsvir olunduğu kimi onları cDNA-ya tərs transkripsiya etməklə kəmiyyətcə müəyyən edilir və sonra qPCR həyata keçirilir.Standart PCR-də olduğu kimi, DNT üç təkrarlanan addımla gücləndirilir: denatürasiya, yumşalma və uzanma.Bununla belə, qPCR-də floresan etiketləmə PCR irəlilədikcə məlumatların toplanmasına imkan verir.Mövcud üsullar və kimyəvi maddələrin genişliyi səbəbindən bu texnikanın bir çox üstünlükləri var.

Boya əsaslı qPCR-də (adətən yaşıl) flüoresan etiketləmə dsDNA bağlayıcı boyadan istifadə etməklə gücləndirilmiş DNT molekullarının kəmiyyətini təyin etməyə imkan verir.Hər bir dövr ərzində flüoresans ölçülür.Floresensiya siqnalı təkrarlanan DNT-nin miqdarına mütənasib olaraq artır.Beləliklə, DNT “real zamanda” kəmiyyətlə müəyyən edilir (şək. 3).Boya əsaslı qPCR-nin çatışmazlıqları odur ki, bir anda yalnız bir hədəf araşdırıla bilər və boya nümunədə mövcud olan hər hansı ds-DNT-yə bağlanacaqdır.

Zond əsaslı qPCR-də hər bir nümunədə eyni vaxtda bir çox hədəf aşkarlana bilər, lakin bu, primerlərə əlavə olaraq istifadə olunan hədəfə xüsusi prob(lar)ın optimallaşdırılmasını və dizaynını tələb edir.Bir neçə növ zond dizaynı mövcuddur, lakin ən çox yayılmış növü flüorofor və söndürücünü özündə birləşdirən hidroliz zondudur.Flüoresan rezonans enerji ötürülməsi (FRET) zond bütöv olarkən söndürücü vasitəsilə flüoroforun emissiyasının qarşısını alır.Bununla belə, PCR reaksiyası zamanı prob primerin uzadılması və bağlı olduğu xüsusi ardıcıllığın gücləndirilməsi zamanı hidroliz edilir.Zondun parçalanması flüoroforu söndürücüdən ayırır və flüoresansın gücləndirilməsindən asılı olaraq artması ilə nəticələnir (şək. 4).Beləliklə, zond əsaslı qPCR reaksiyasından gələn flüoresan siqnal nümunədə mövcud olan zond hədəf ardıcıllığının miqdarı ilə mütənasibdir.Zond əsaslı qPCR boya əsaslı qPCR-dən daha spesifik olduğundan, bu, çox vaxt qPCR əsaslı diaqnostik analizlərdə istifadə olunan texnologiyadır.

İzotermik gücləndirmə

Yuxarıda qeyd olunan PCR üsulları denaturasiya, yumşalma və uzatma mərhələləri üçün kameranın temperaturlarını dəqiq şəkildə yüksəltmək və aşağı salmaq üçün bahalı termosiklinq avadanlığı tələb edir.Bu cür dəqiq cihazlara ehtiyac duymayan və sadə su banyosunda və ya hətta maraq göstərən hüceyrələr daxilində həyata keçirilə bilən bir sıra texnikalar hazırlanmışdır.Bu üsullar ümumi olaraq izotermik gücləndirmə adlanır və eksponensial, xətti və ya kaskad gücləndirilməsi əsasında işləyir.

İzotermik gücləndirmənin ən məşhur növü loop vasitəçiliyi ilə izotermik gücləndirmə və ya LAMP-dır.LAMP şablon DNT və ya RNT-ni gücləndirmək üçün 65⁰C-də eksponensial gücləndirmədən istifadə edir.LAMP həyata keçirərkən, yeni DNT sintez etmək üçün DNT polimeraza ilə hədəf DNT bölgələrini tamamlayan dörd-altı primer istifadə olunur.Bu primerlərdən ikisi digər primerlərdəki ardıcıllıqları tanıyan və onları birləşdirən əlavə ardıcıllığa malikdir, bu da yeni sintez edilmiş DNT-də “dövrə” strukturunun əmələ gəlməsinə imkan verir ki, bu da sonrakı gücləndirmə dövrlərində primerin bağlanmasına kömək edir.LAMP flüoresans, agaroz gel elektroforezi və ya kolorimetriya daxil olmaqla bir çox üsulla görüntülənə bilər.Kolorimetriya yolu ilə məhsulun varlığını və ya olmamasını vizuallaşdırmaq və aşkar etmək asanlığı və tələb olunan bahalı avadanlığın olmaması LAMP-ı klinik laboratoriya testlərinin asanlıqla əldə olunmadığı ərazilərdə SARS-CoV-2 testi və ya nümunələrin saxlanması və daşınması üçün uyğun seçim etdi. mümkün deyildi və ya əvvəllər PCR termosiklinq avadanlığı olmayan laboratoriyalarda.