Real Time PCR, həmçinin kəmiyyət PCR və ya qPCR kimi tanınan, PCR gücləndirmə məhsullarının real vaxt rejimində monitorinqi və təhlili üçün bir üsuldur.
Kəmiyyət PCR sadə əməliyyat, sürətli və rahat, yüksək həssaslıq, yaxşı təkrarlanma və aşağı çirklənmə dərəcəsi üstünlüklərinə malik olduğundan, tibbi testlərdə, dərmanların effektivliyinin qiymətləndirilməsində, gen ifadə tədqiqatlarında, transgenik tədqiqatlarda, gen aşkarlanmasında, patogen aşkarlanmasında, heyvan və bitkilərin aşkarlanmasında geniş istifadə olunur., qida sınaqları və digər sahələr.
Buna görə də, istər həyat elmləri sahəsində fundamental tədqiqatlarla məşğul olsanız, istər əczaçılıq şirkətlərinin, heyvandarlıq şirkətlərinin, qida şirkətlərinin işçiləri və ya hətta giriş-çıxış müfəttişliyi və karantin bürolarının, ətraf mühitin monitorinqi şöbələrinin, xəstəxanaların və digər bölmələrin əməkdaşlarından asılı olmayaraq, siz az-çox məruz qalacaqsınız.

Real Time PCR prinsipi

Real Time PCR, PCR reaksiya sisteminə flüoresan maddələrin əlavə edildiyi və PCR reaksiyası prosesində flüoresan siqnal intensivliyinin kəmiyyət PCR aləti ilə real vaxt rejimində izlənilməsi və nəhayət, eksperimental məlumatların təhlili və işlənməsi üsuludur.

【Gücləndirmə əyrisi】PCR-in dinamik prosesini təsvir edən əyridir.PCR-in gücləndirmə əyrisi əslində standart eksponensial əyri deyil, sigmoid əyridir.

[Gücləndirmə əyrisinin platforma mərhələsi]PZR dövrlərinin sayının artması, DNT polimerazanın inaktivasiyası, dNTP-lərin və primerlərin tükənməsi və əlavə məhsul pirofosfat reaksiyası ilə sintez reaksiyasının inhibə edilməsi və s. ilə PCR həmişə eksponensial şəkildə genişlənmir., və nəticədə bir yayla girəcək.

[Gücləndirmə əyrisinin eksponensial artım bölgəsi]Yayla mərhələsi çox dəyişsə də, gücləndirmə əyrisinin eksponensial artım bölgəsinin müəyyən bölgəsində təkrarlanma qabiliyyəti çox yaxşıdır, bu da PCR-nin kəmiyyət təhlili üçün çox vacibdir.

[Sərhəd dəyəri və Ct dəyəri]Biz gücləndirmə əyrisinin eksponensial artım sahəsində müvafiq mövqedə flüoresans aşkarlamasının həddi dəyərini, yəni hədd dəyərini (ərəfəsində) təyin etdik.Eşik dəyəri ilə gücləndirmə əyrisinin kəsişməsi Ct dəyəridir, yəni Ct dəyəri hədd dəyərinə çatdıqda dövrlərin sayına (Threshold Cycle) aiddir.

Aşağıdakı qrafik eşik xətti ilə gücləndirmə əyrisi, həddi və Ct dəyəri arasındakı əlaqəni aydın şəkildə göstərir.

【Kəmiyyəti necə təyin etmək olar?】

Riyazi nəzəriyyə ilə sübut edilmişdir ki, Ct qiyməti ilkin şablonların sayının loqarifmi ilə tərs xətti əlaqəyə malikdir.Real Time PCR, PCR gücləndirmə məhsullarına real vaxt rejimində nəzarət edir və eksponensial gücləndirmə mərhələsində onların kəmiyyətini müəyyən edir.

Hər bir PCR dövrü üçün DNT eksponent olaraq 2 dəfə artdı və tezliklə platoya çatdı.

Başlanğıc DNT-nin miqdarının A olduğunu fərz etsək₀ , n dövrədən sonra DNT məhsulunun nəzəri miqdarı aşağıdakı kimi ifadə edilə bilər:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Sonra, ilkin DNT miqdarı A 0 nə qədər çox olarsa, gücləndirilmiş məhsulun miqdarı An aşkarlama dəyərinə bir o qədər tez çatar və An-a çatdıqda dövrlərin sayı Ct dəyəridir.Yəni, ilkin DNT miqdarı A 0 nə qədər çox olarsa, gücləndirmə əyrisi bir o qədər tez zirvəyə çatır və müvafiq olaraq tələb olunan dövrlərin sayı n daha kiçik olur.

Biz məlum konsentrasiyanın standartının gradient seyreltilməsini həyata keçiririk və ondan Real Time PCR üçün şablon kimi istifadə edirik və DNT miqdarının başlanğıcdan daha azına doğru bərabər intervallarla bir sıra gücləndirmə əyriləri əldə ediləcək.Ct dəyəri ilə başlanğıc şablonların sayının loqarifmi arasındakı xətti əlaqəyə görə,[standart əyri] yaradıla bilər.

Naməlum konsentrasiyalı nümunənin Ct dəyərini standart əyriyə əvəz etməklə, Real Time PCR-in kəmiyyət prinsipi olan naməlum konsentrasiyalı nümunənin ilkin şablon miqdarını əldə etmək olar.

Real Time PCR aşkarlama üsulu

Real Time PCR reaksiya sistemində flüoresan intensivliyini aşkar edərək PCR gücləndirmə məhsullarını aşkar edir.

Floresan Boya Yerləşdirmə Metodunun Prinsipləri】

Floresan boyalar, məsələn, TB Green ®, PCR sistemlərində ikiqat zəncirli DNT-yə qeyri-spesifik olaraq bağlana bilər və bağlandıqdan sonra flüoresanlaşa bilər.

Reaksiya sistemindəki flüoresan intensivliyi PCR dövrlərinin artması ilə eksponent olaraq artdı.Flüoresans intensivliyini aşkar edərək, reaksiya sistemində DNT gücləndirilməsinin miqdarını real vaxt rejimində izləmək və sonra nümunədəki başlanğıc şablonun miqdarını tərs qiymətləndirmək olar.

【Floresan zond metodunun prinsipi】

floresan zond5′ ucunda flüoresan qrupu və 3′ ucunda söndürmə qrupu olan nuklein turşusu ardıcıllığıdır, şablona xüsusi olaraq bağlana bilir.Zond bütöv olduqda, flüoroforun yaydığı flüoresans söndürmə qrupu tərəfindən söndürülür və flüoresan ola bilməz.Zond parçalandıqda, flüoresan maddə dissosiasiya ediləcək və flüoresan yayacaq.

PCR reaksiya məhluluna flüoresan zond əlavə edilir.Yuvlama prosesi zamanı flüoresan zond şablonun xüsusi mövqeyinə bağlanacaq.Uzatma prosesi zamanı PCR fermentinin 5′→3′ eksonükleaz aktivliyi şablonla hibridləşdirilmiş flüoresan zondu parçalaya bilər və flüoresan maddə flüoresans yaymaq üçün dissosiasiya olunur.Reaksiya sistemində zondun flüoresan intensivliyini aşkar etməklə, PCR məhsulunun gücləndirmə miqdarının monitorinqi məqsədinə nail olmaq olar.

【Floresensin aşkarlanması metodunun seçilməsi】

Yüksək homologiyaya malik ardıcıllıqları ayırd etmək və SNP tipləmə analizi kimi multipleks PCR aşkarlamasını həyata keçirmək üçün istifadə edilərsə, flüoresan zond metodu əvəzolunmazdır.
Digər Real Time PCR təcrübələri üçün sadə, asan və aşağı qiymətli flüoresan kimera metodundan istifadə edilə bilər.

probesGüclü spesifiklik, multipleks PCR qabiliyyətinə malikdir

Çatışmazlıq

Gücləndirmə üçün yüksək spesifiklik tələbləri;

multipleks PCR həyata keçirilə bilməz. Xüsusi zondların dizaynına ehtiyac var, yüksək qiymət;

bəzən prob dizaynı çətindir

Əlaqədar məhsullar: