Başlanğıc material: RNT
Kəmiyyət tərs transkripsiya PCR (RT-qPCR) başlanğıc material kimi RNT istifadə edərək PCR təcrübələrində istifadə edilən eksperimental metoddur.Bu üsulda ümumi RNT və ya messencer RNT (mRNA) əvvəlcə əks transkriptaza ilə tamamlayıcı DNT-yə (cDNA) transkripsiya edilir.Daha sonra cDNA-dan şablon kimi istifadə edərək qPCR reaksiyası aparıldı.RT-qPCR müxtəlif molekulyar biologiya tətbiqlərində, o cümlədən gen ifadə analizi, RNT müdaxiləsinin yoxlanılması, mikroarray yoxlaması, patogen aşkarlanması, genetik test və xəstəlik tədqiqatlarında istifadə edilmişdir.
RT-qPCR üçün bir addımlı və iki addımlı üsullar
RT-qPCR bir addımlı və ya iki addımlı üsulla həyata keçirilə bilər.Bir addımlı RT-qPCR əks transkripsiya və PCR gücləndirilməsini birləşdirir, əks transkriptaza və DNT polimerazanın eyni bufer şəraitində eyni boruda reaksiyanı tamamlamasına imkan verir.Bir addımlı RT-qPCR yalnız ardıcıllıqla xüsusi primerlərin istifadəsini tələb edir.İki addımlı RT-qPCR-də əks transkripsiya və PCR gücləndirilməsi müxtəlif optimallaşdırılmış tamponlar, reaksiya şərtləri və primer dizayn strategiyalarından istifadə etməklə iki boruda həyata keçirilir.
| Üstünlük | Mənfi cəhəti | |
| Bir addım | Hər iki reaksiya bir boruda aparıldığı üçün bu üsul daha az eksperimental xətaya malikdir
Daha az pipetləmə addımları çirklənmə riskini azaldır
Yüksək məhsuldarlıqlı gücləndirmə/ekran üçün uyğundur, sürətli və təkrarlana bilir | İki mərhələli reaksiyalar ayrıca optimallaşdırıla bilməz
İki addımlı reaksiyanın birləşdirilməsi ilə reaksiya şəraiti pozulduğu üçün həssaslıq iki addımlı metodunki qədər yaxşı deyil.
Tək bir nümunə ilə aşkar edilən hədəflərin sayı azdır |
| İki Addım | Uzun müddət saxlanıla bilən və çoxsaylı reaksiyalarda istifadə edilə bilən sabit cDNT kitabxanaları yaratmaq bacarığı
Hədəf genləri və istinad genləri bir çox cDNA kitabxanasına ehtiyac olmadan eyni cDNA kitabxanasından gücləndirilə bilər.
Tək reaksiya işlərinin optimallaşdırılmasına imkan verən reaksiya tamponları və reaksiya şəraiti
Tətik şərtlərinin çevik seçimi | Çoxlu boruların istifadəsi və daha çox pipetləmə addımları DNT ilə çirklənmə riskini artırır, və vaxt aparan.
Bir addımlı metoddan daha çox optimallaşdırma tələb edir |
Əlaqədar məhsullar:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Bir Addım)-SYBR Yaşıl I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Bir Addım)-Təqman
RT Easyᵀᴹ Birinci Strand CDNA Sintezi üçün I Master Premiks
Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Ümumi RNT və mRNT-nin seçilməsi
RT-qPCR təcrübəsini tərtib edərkən, əks transkripsiya üçün şablon kimi ümumi RNT və ya təmizlənmiş mRNT-dən istifadə edib-etməmək barədə qərar vermək vacibdir.mRNT bir qədər yüksək həssaslıq təmin edə bilsə də, ümumi RNT hələ də tez-tez istifadə olunur.Bunun səbəbi ümumi RNT-nin mRNT-dən daha əhəmiyyətli bir başlanğıc material kimi üstünlüyü olmasıdır.Birincisi, proses daha az təmizləmə addımları tələb edir ki, bu da şablonun daha yaxşı kəmiyyətcə bərpasını və nəticələrin başlanğıc hüceyrə nömrələrinə daha yaxşı normallaşmasını təmin edir.İkincisi, o, müxtəlif mRNA-ların müxtəlif bərpası nəticəsində əyri nəticələrin mümkünlüyünün qarşısını ala bilən mRNT zənginləşdirmə addımından qaçır.Ümumiyyətlə, əksər tətbiqlərdə hədəf genin nisbi kəmiyyəti aşkarlamanın mütləq həssaslığından daha vacib olduğundan, ümumi RNT əksər hallarda daha uyğundur.
Əks transkripsiya primeri
İki addımlı metodda cDNA reaksiyasını hazırlamaq üçün üç müxtəlif üsuldan istifadə edilə bilər: oliqo(dT) primerlər, təsadüfi primerlər və ya ardıcıllığa xüsusi primerlər.Tipik olaraq, oliqo(dT) primerləri və təsadüfi primerlər kombinasiyada istifadə olunur.Bu primerlər şablon mRNT zəncirinə bağlanır və sintez üçün başlanğıc nöqtəsi olan tərs transkriptaza təmin edir.
| Astar seçimi | Struktur və funksiya | Üstünlük | Mənfi cəhəti |
| Oliqo(dT) astar (və ya lövbərlənmiş oliqo(dT) astar) | mRNT-nin poli(A) quyruğunda timin qalıqlarına uzadılmış yumşalma;anker oliqo(dT) primeri 3′ ucunda (lövbər yeri) G, C və ya A ehtiva edir | Poli(A) quyruqlu mRNT-dən tam uzunluqlu cDNT-nin sintezi
Daha az başlanğıc materialı olduqda tətbiq edilir
Ankraj yeri oliqo(dT) primerinin mRNT-nin 5′ poli(A) quyruğuna bağlanmasını təmin edir. | Yalnız poli(A) quyruqlu genləri gücləndirmək üçün uyğundur
Poli(A)-da astarlama yerindən*2 kəsilmiş cDNT əldə edin
3′ ucuna bağlamaq üçün qərəzli *
*Anchored oliqo(dT) primerləri istifadə edilərsə, bu ehtimal minimuma endirilir |
| təsadüfi primer
| RNT transkripsiyası zamanı bir çox sahəyə bağlana bilən uzunluğu 6-9 əsasdır | Bütün RNT-lərə (tRNT, rRNA və mRNA) bağlanır.
Əhəmiyyətli ikinci dərəcəli struktura malik transkriptlər üçün və ya daha az başlanğıc materialı olduqda uyğundur
Yüksək cDNA məhsuldarlığı | cDNA bütün RNT-dən əks transkripsiya edilir, bu adətən arzuolunmazdır və hədəf mRNT-nin siqnalını sulandıra bilər.
kəsilmiş cDNA əldə edin |
| ardıcıllıqla spesifik primerlər | Xüsusi mRNT ardıcıllığını hədəf alan xüsusi primerlər | xüsusi cDNA kitabxanası
Həssaslığı yaxşılaşdırın
Əks qPCR primerlərindən istifadə | Yalnız bir hədəf genin sintezi ilə məhdudlaşır |
Əks transkriptaza
Əks transkriptaza, DNT-ni sintez etmək üçün RNT-dən istifadə edən bir fermentdir.Bəzi tərs transkriptazalar RNaz aktivliyinə malikdir və transkripsiyadan sonra RNT-DNT hibrid zəncirlərindəki RNT zəncirlərini deqradasiya edə bilər.RNase enzimatik aktivliyinə malik deyilsə, daha yüksək qPCR səmərəliliyi üçün RNaseH əlavə edilə bilər.Tez-tez istifadə olunan fermentlərə Moloney fare leykemiya virusu əks transkriptaza və quş mieloblastoma virusunun əks transkriptaza daxildir.RT-qPCR üçün daha yüksək termostabilliyə malik əks transkriptaza seçmək idealdır ki, cDNT sintezi daha yüksək temperaturda həyata keçirilsin, daha yüksək ikinci dərəcəli struktura malik RNT-lərin uğurlu transkripsiyasını təmin etsin, eyni zamanda onların bütün reaksiya boyu aktivliyini qorusun, nəticədə cDNA məhsuldarlığı yüksək olsun.
Əlaqədar məhsullar:
Öncədən M-MLV Əks Transkriptaza
Əks transkriptazın RNase H aktivliyi
RNaseH, RNT-DNT duplekslərindən RNT zəncirlərini deqradasiya etməyə qadirdir, ikiqat zəncirli DNT-nin səmərəli sintezinə imkan verir.Bununla belə, uzun mRNT-dən şablon kimi istifadə edildikdə, RNT vaxtından əvvəl pozula bilər və nəticədə cDNT kəsilir.Buna görə də, uzun transkriptlərin sintezi arzu edilirsə, cDNA klonlaması zamanı RNaseH aktivliyini minimuma endirmək çox vaxt faydalıdır.Bunun əksinə olaraq, RNase H aktivliyi olan əks transkriptazalar qPCR tətbiqləri üçün çox vaxt faydalıdır, çünki onlar PCR-nin ilk dövrü ərzində RNT-DNT duplekslərinin əriməsini gücləndirirlər.
Astar dizaynı
RT-qPCR-də qPCR addımı üçün istifadə edilən PCR primerləri ideal olaraq ekson-ekson qovşağını əhatə edəcək şəkildə tərtib edilməlidir, burada gücləndirici primer potensial olaraq faktiki ekson-intron sərhədini əhatə edə bilər.İntron tərkibli genomik DNT ardıcıllıqları gücləndirilmədiyi üçün bu dizayn genomik DNT-nin çirklənməsi nəticəsində gücləndirilmiş yalançı pozitivlərin riskini azaldır.
Primerlər eksonları və ya ekson-ekson sərhədlərini ayırmaq üçün nəzərdə tutula bilmirsə, genomik DNT çirklənməsini aradan qaldırmaq üçün RNT nümunələrini RNazsız DNase I və ya dsDNase ilə müalicə etmək lazım ola bilər.
RT-qPCR nəzarəti
DNT-nin çirklənməsini (məsələn, əvvəlki reaksiyaların genomik DNT və ya PCR məhsulları) aşkar etmək üçün bütün RT-qPCR təcrübələrinə əks transkripsiya mənfi nəzarəti (-RT nəzarəti) daxil edilməlidir.Bu nəzarət əks transkriptaza istisna olmaqla, bütün reaksiya komponentlərini ehtiva edir.Bu nəzarətlə əks transkripsiya baş vermədiyindən, PCR gücləndirilməsi müşahidə olunarsa, DNT-dən çirklənmə ehtimalı yüksəkdir.
Göndərmə vaxtı: 02 avqust 2022-ci il
