1. RNT məhlulunun udulmasını aşkar edin
280, 320, 230 və 260 nm-də absorbsiya müvafiq olaraq nuklein turşusu, fon (məhlulun bulanıqlığı), duz konsentrasiyası və zülal kimi üzvi maddələrin dəyərlərini təmsil edir.Ümumiyyətlə yalnız OD260/OD280-ə baxın (Ratio, R).1.8~2.0 olduqda, RNT-də zülalın və ya digər üzvi maddələrin çirklənməsinə yol verilə biləcəyini düşünürük, lakin qeyd etmək lazımdır ki, Tris absorbansın aşkarlanması üçün tampon kimi istifadə edildikdə, R dəyəri 2-dən çox ola bilər (ümumiyyətlə <2.2 olmalıdır).R<1.8 olduqda, məhlulda zülalın və ya digər üzvi maddələrin çirklənməsi daha aydın görünür və RNT-nin taleyini ehtiyaca uyğun olaraq təyin etmək olar.R>2.2 olduqda, bu, RNT-nin tək nuklein turşusuna hidroliz edildiyini bildirir.
2.RNT-nin elektroforetik nümunəsi
Ümumiyyətlə, RNT elektroforezi üçün denaturasiya geli istifadə olunur, lakin bu, yalnız RNT-nin keyfiyyətini aşkar etmək üçündürsə, denaturasiya geli lazım deyil və adi agaroza geldən istifadə etmək olar.Elektroforezin məqsədi 28S və 18S zolaqlarının bütövlüyünü və onların nisbətini və ya mRNT yaxmasının bütövlüyünü aşkar etməkdir.Ümumiyyətlə, əgər 28S və 18S zolaqları parlaq, aydın və kəskindirsə (zolağın kənarları aydındırsa) və 28S-nin parlaqlığı 18S diapazonundan iki dəfə artıqdırsa, biz RNT-nin keyfiyyətini yaxşı hesab edirik.
Yuxarıdakılar çox istifadə etdiyimiz iki üsuldur, lakin bu iki üsuldan heç biri RNT məhlulunda qalıq RNase olub-olmadığını dəqiq deyə bilməz.Əgər məhlulda çox az miqdarda RNase varsa, onu yuxarıda göstərilən üsulla aşkar etmək bizim üçün çətindir, lakin sonrakı fermentativ reaksiyaların əksəriyyəti 37 dərəcədən yuxarı və uzun müddət ərzində aparılır.Bu şəkildə RNT məhlulunda çox az miqdarda RNaz varsa, o zaman sonrakı təcrübələrdə öz rolunu oynamaq üçün çox uyğun bir mühit və zaman yaranacaq və təbii ki, bu zaman təcrübə soyuq keçəcək.Aşağıda RNT məhlulunda qalıq RNase olub-olmadığını təsdiq edə biləcək bir üsul təqdim edirik.
3. İstiliyin qorunması testi
Nümunə konsentrasiyasına uyğun olaraq, RNT məhlulundan iki 1000 ng RNT çəkin və onu 0,5 ml sentrifuqa borusuna əlavə edin və ümumi həcmi 10 ul olana qədər pH 7,0 Tris tamponu ilə əlavə edin və sonra borunun qapağını bağlayın.Onlardan birini 70°C temperaturda sabit su banyosuna qoyun və 1 saat isti saxlayın.Digər hissə isə -20°C soyuducuda 1 saat saxlanılır.Vaxt bitdikdə, elektroforez üçün iki nümunəni çıxarın.Elektroforez başa çatdıqdan sonra ikisinin elektroforetik zolaqlarını müqayisə edin.Əgər hər ikisinin zolaqları ardıcıldırsa və ya əhəmiyyətli fərq yoxdursa (təbii ki, onların zolaqları da 2-ci üsuldakı şərtlərə cavab verir), bu o deməkdir ki, RNT məhlulunda qalıq RNaz çirklənməsi yoxdur və RNT-nin keyfiyyəti çox yaxşıdır.Əksinə, 70°C-də inkubasiya edilmiş nümunə aşkar deqradasiya göstərirsə, bu, RNT məhlulunda RNaz çirklənməsinin olduğunu göstərir.
2 RNT ekstraksiyasının eksperimental üsulları və üsulları
RNT çıxararkən tez-tez qarşılaşdığımız problemlər bunlardır: (1) RNT məhsuldarlığı aşağıdır;(2) RNT ciddi duz çirklənməsinə malikdir;(3) RNT-nin ciddi üzvi həlledici çirklənməsi var;(4) nümunənin deqradasiyası və digər problemlər
1. Ümumi istifadə edilən ümumi RNT ekstraksiya reagentləri
Quanidin izotiosiyanat üsulu və Trizol üsulu heyvan toxumalarından və heyvan hüceyrələrindən ümumi RNT-nin çıxarılması üçün ən çox istifadə edilən üsullardır.Xüsusilə dovşan dərisindən və heyvan birləşdirici toxumasından ümumi RNT-nin çıxarılması kimi çıxarılması xüsusilə çətin olan kiçik nümunələr və toxumalar üçün uyğundur;Bundan əlavə, Trizol, ümumi təyinatlı liziz reagenti kimi, bitki toxumalarının, bakteriyaların, göbələklərin və digər toxumaların çıxarılması üçün də istifadə edilə bilər.Tərkibində polisaxaridlər və polifenollar olan bitki toxumaları, məsələn kameliya oleifera, çay yarpağı, kolza və s., CTAB üsulu ümumi RNT-nin çıxarılması üçün də istifadə edilə bilər.
Adi bir üsul olaraq, iki sütunlu üsul normal temperaturda işləməsi, RNaz əlavə etməyə ehtiyac olmaması və təhlükəsizliyə görə çox populyardır - ekstraksiya üçün xloroform, fenollar və digər üzvi reagentlər yoxdur.(tövsiyə olunan məhsullar )
2. Heyvan toxumalarından ümumi RNT-nin çıxarılması
(1) Təzə deyilsə, təzə toxuma seçməyə çalışın (üç ay ərzində - 80 ℃ soyuducuda və ya maye azotda dondurulmuş halda. Toxumanı kəsərkən birbaşa otaq temperaturunda kəsməyin, mütləq buz qutusuna qoyun, təkrar dondurulma və ərimənin qarşısını almağa çalışın.
(2) Kiçik bir toxuma parçasını kəsmək üçün təmiz qayçı və cımbızdan istifadə edin, nümunəni kəsərkən toxumanın mərkəzi hissəsini kəsməyə çalışın və ya əvvəlcə ortadan böyük toxuma parçasını kəsin, sonra nümunəni təzə kəsik mövqeyində kəsin.Çıxarılan toxuma tam xırdalanmalı, xırdalanmış toxuma RNase olmayan EP borusuna qoyulmalı, lizat əlavə edilməli, xırdalanmış toxuma tam olaraq lizata məruz qalmalı və homogenləşdirməyə hazırlaşmalıdır.
(3) Normal toxumalar üçün homogenləşmə üçün maş paxlası ölçüsündə toxumaları (30-60 mq) seçin.Əgər toxumalarda çox miqdarda protein, yağ və ya qaraciyər kimi sıx lifli toxumalar varsa, kəsilmiş toxumaların miqdarını müvafiq olaraq artırın və ya azaldın (isteğe bağlı) 10~20 mq seçin).
(4) Əgər balıq əzələsi, karides əti, meduza və yüksək sulu digər toxumalar çıxarılarsa, nümunənin həcmi müvafiq olaraq artırılmalıdır (tövsiyə olunan 100-200 mq).
(5) Əgər şərait imkan verirsə, heyvan toxuması yüksək keçidli toxuma homogenizatoru ilə homojenləşdirildikdən sonra, belə avadanlıq yoxdursa, birbaşa ekstraksiya edilə bilər.
(6) Son ekstraksiyadan sonra əldə edilən RNT RNT-nin parçalanmasını azaltmaq üçün dərhal buz qutusuna yerləşdirilməlidir.
3. Heyvan hüceyrəsi RNT-nin çıxarılması
(1) Süspansiyon hüceyrələri: birbaşa sentrifuqa edin və mühiti atın, steril PBS ilə 1-2 dəfə yuyun, sonra müvafiq miqdarda PBS ilə dayandırın və sonra lizis üçün lizat əlavə edin.Lizatı mayeni tamamilə atdıqdan sonra birbaşa çökmüş hüceyrələrə əlavə etməyin.Bu, xarici təbəqədəki lizis hüceyrələrdən sonra sərbəst buraxılan histon paketinin çökmüş hüceyrələrin xarici tərəfinə yapışmasına səbəb olacaq və bununla da qranul daxilindəki hüceyrələrin lizatla təmasını məhdudlaşdıracaq., natamam hüceyrə lizisi və RNT məhsuldarlığının azalması ilə nəticələnir.
(2) Yarıyapışan və ya sıx yapışmayan hüceyrələr: mühiti atdıqdan sonra 1-2 dəfə PBS ilə yuyun, sonra müvafiq miqdarda PBS-ni birbaşa absorbe edin və hüceyrələri üfürmək üçün mədəniyyət qabını pipet və ya silahla üfürün və onları RNT-siz hüceyrələrə köçürün.Ekstraksiya üçün fermentin EP borusuna lizat əlavə edin.
(3) Yapışqan hüceyrələr: əvvəlcə tripsinlə həzm edilməli, sonra RNazsız EP borularına yığılmalı, supernatantı çıxarmaq üçün sentrifuqadan keçirilməli, artıq tripsini çıxarmaq üçün PBS ilə 1-2 dəfə yuyulmalı və müvafiq miqdarda PBS ilə yenidən dayandırılmalıdır. Sonra ekstraksiya mərhələsinə keçin.
4. Bitki RNT çıxarılması
Bitki toxumaları fenol birləşmələri ilə zəngindir və ya polisaxaridlərlə zəngindir və ya bəzi naməlum ikincil metabolitləri ehtiva edir və ya RNaz-ın yüksək aktivliyinə malikdir.Bu maddələr hüceyrə lizisindən sonra RNT ilə sıx birləşərək həll olunmayan komplekslər və ya kolloid çöküntülər əmələ gətirir, onları çıxarmaq çətindir.Buna görə də, biz bitki toxumasını çıxararkən, bitkilər üçün bir dəst seçməliyik.Kitdəki lizat polifenolların asan oksidləşməsi və polisaxarid birləşmələrinin və nuklein turşularının ayrılması problemlərini effektiv şəkildə həll edə bilər.
(Polisaxarid polifenol bitki RNT ekstraktı üçün tövsiyə olunan məhsullar:
(1) Bitkinin qabığı, pulpası, toxumu, yarpaqları və s. tam olaraq havan içində üyüdülməlidir.Taşlama prosesi zamanı nümunənin əriməsinin qarşısını almaq üçün maye azot vaxtında doldurulmalıdır.Torpaq nümunəsi lizata tez əlavə edilməli və RNT deqradasiyasının qarşısını almaq üçün çalxalanmalıdır.
(2) Düyü və buğda yarpaqları kimi liflə zəngin nümunələr üçün ekstraksiya miqdarı müvafiq şəkildə azaldılmalıdır, əks halda toxuma üyüdülməsi və lizis tamamlanmayacaq, nəticədə ekstraksiya edilmiş RNT-nin aşağı məhsuldarlığı əldə edilir.
(3) Nar meyvəsi, qarpız meyvəsi, şaftalı meyvəsi və s. kimi yüksək sulu bitki toxumaları üçün nümunə ölçüsü müvafiq olaraq artırılmalıdır (100-200 mq isteğe bağlıdır).
(4) Bitki yarpaqları, rizomlar, sərt meyvələr və digər materiallar kimi bitki toxumalarına, adətən, inqrediyentləri havan içinə yaxşıca harçlamaq üçün maye azotdan istifadə etmək və sonra ekstraksiya mərhələsinə keçmək tövsiyə olunur.Adi toxuma homojenizatorları bitki toxumalarının homogenləşdirilməsində təsirli olmaya bilər və ümumiyyətlə tövsiyə edilmir.
5. RNT çıxarılması üçün ehtiyat tədbirləri
(1) Toxuma nümunələri təkrar dondurulma və ərimənin qarşısını almaq üçün mümkün qədər təzə olmalıdır.
(2) Ekstraksiya zamanı toxuma tam üyüdülməlidir və toxumanın miqdarı çox olması bir yana, çox az olmamalıdır.
(3) Nümunəni tam lizizə etmək üçün lizat əlavə edildikdən sonra kifayət qədər inkubasiya vaxtı verilməlidir.
(4) Ekstraksiya üçün Trizol metodundan istifadə edərkən, təbəqələşmədən sonra supernatantın udulması prinsipi "daha çox nəfəs almaqdan daha az nəfəs almağa üstünlük verir" və orta təbəqəyə çıxarmamalıdır, əks halda bu, ciddi genomik DNT çirklənməsinə səbəb olacaqdır.
(5) Yuma zamanı hərtərəfli yuyulmağı təmin etmək üçün yuyucu maye boru divarının ətrafına tam sızmalıdır.
(6) Sütun çıxarılması üsulu üçün, yuyulduqdan sonra sütunu ayırmaqla yanaşı, adsorbsiya sütunu da ultra təmiz bir dəzgahda yerləşdirilməli və üzvi həlledicinin quruyana qədər tam buxarlanması üçün 5-10 dəqiqə üfürülməlidir.
(7) Sütun üsulunun son elüsyonunda DEPC suyu əlavə edildikdən sonra 3-5 dəqiqə inkubasiya edilməli və ya elüsyon məhsuldarlığını artırmaq üçün DEPC suyu əvvəlcədən 60°C-ə qədər qızdırılmalıdır.Ənənəvi Trizol parçalanması və izopropanol çökdürmə metodunda son RNT DEPC suyunda həll edilir, ona görə də həll olunmaq üçün müvafiq vaxt verilməli və sentrifuqa borusunun dibi davamlı olaraq pipet ucu ilə üfürülməlidir.
3 TAşağı RNT konsentrasiyası/pis keyfiyyətin səbəbləri və həlləri
1. Məhsuldarlıq çox aşağıdır
Çıxarılan nümunə çox azdır, ümumi məbləğ qeyri-kafidir və ya çıxarılan nümunə həddindən artıqdır və lizis tamamlanmamışdır;Ekstraksiya üçün müvafiq keyfiyyətli toxuma və ya hüceyrələrdən istifadə edilməli, nümunənin ilkin müalicəsi yaxşı aparılmalı və lizis kifayət qədər olmalıdır.
2. Genom qalıqları
Trizol üsulu ilə ekstraksiya zamanı laylanmadan sonra supernatant orta təbəqəyə sorulduğunda genomun ciddi çirklənməsi baş verəcək;Orta təbəqəyə hopmamaq üçün qatlanarkən əlavə diqqət yetirilməlidir.Sütun üsulu ekstraksiya üçün istifadə edilərsə, ekstraksiya üçün DNase I olan dəst seçilə bilər.Membran üzərində adsorbsiya olunan nuklein turşusu birbaşa DNaz I ilə həzm olunur ki, bu da DNT qalıqlarını əhəmiyyətli dərəcədə azalda bilər.
3. RNT-nin deqradasiyası
Bu, çıxarılan nümunənin özünün deqradasiyası və ya çıxarılması prosesi zamanı yaranan deqradasiya ola bilər;mümkün qədər təzə nümunələrdən RNT çıxarılması üçün istifadə edilməli və toplanmış nümunələr vaxtında maye azotda və ya -80°C soyuducuda saxlanmalı və təkrar dondurulma və ərimə hallarına yol verilməməlidir.RNT-nin çıxarılması prosesində RNaz/DNazsız uclar, sentrifuqa boruları və digər materiallardan istifadə edilməlidir.Çıxarma prosesi mümkün qədər sürətli olmalıdır.Çıxarılan RNT buz qutusuna qoyulmalı və vaxtında -80-də saxlanmalıdır.Çıxarılan RNT-nin gel elektroforezi ilə aşkarlanması lazımdırsa, ekstraksiyadan dərhal sonra elektroforez aparılmalı və elektroforez tamponu yeni hazırlanmış biri ilə əvəz edilməlidir.
4. Duz və üzvi həlledici qalıqları
Ekstraksiya reagentlərinin tərkibində fenol və quanidin duzları, yuyucu məhlulda isə etanol var.Ekstraksiya prosesi zamanı lizat tamamilə udulmayıb və atılmayıb, yuyucu məhlul isə tam qurudulmayıb.Qalıq duzlar və üzvi həlledicilər sonrakı tərs transkripsiya və PCR üçün zərərlidir.Müxtəlif inhibe dərəcələri, buna görə də ekstraksiya prosesində toxuma lizatının tamamilə çıxarılması lazımdır və yuyulma kifayət qədər olmalıdır ki, borunun ətrafdakı divarları yuyula bilsin.Bundan əlavə, boru boşaldılır və üfürülür, üzvi maddələrin qalıqlarını daha da azaldacaq zəruri bir addımdır.
RNT hasilatı haqqında ətraflı məlumat üçün vebsaytımızı izləyin:
Əlavə məlumat üçün www.foreivd.com.
Göndərmə vaxtı: 01 dekabr 2022-ci il
